蒺藜苜蓿MtNSN1的克隆與功能分析

張智琦，王珍，張鐵軍，龍瑞才，楊青川，康俊梅

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193)

核干因子(nucleostemin，NS)是一種廣泛存在于動植物和微生物中調控器官生長和發育的包含了rRNA前體加工蛋白的大型蛋白復合體。與rRNA合成相關的結構表明它在核糖體生物起源中起著重要的作用[1-2]。同時，NS主要在與生長發育密切相關的干細胞中表達，也表明了其對生長發育具有一定的調控作用[3]。因此研究NS在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中的同源基因MtNSN1在生長發育方面的功能，可以為提高苜蓿的產量提供一種新的思路。NS作為原核生物和真核生物中保守的鳥苷三磷酸酶(GTPase)的成員，屬于參與核糖體生物發生、細胞增殖和細胞生長的YlqF/YawG GTPase家族[4]。NS首次被發現于小鼠的干細胞和部分癌細胞中，研究發現在抑制小鼠雙微體基因(murine double minute 2，MDM2)活性的條件下，NS在小鼠體內的損耗或超表達會引起G1-S和G2-M轉化的停滯[5]。MDM2是一種E3泛素連接酶，E3泛素連接酶特異性的識別靶標蛋白，其在植物生長發育和抗逆過程中也起著重要作用[6-7]。在人體中對NS家族的研究發現其包括3種類型，即核干因子、類鳥嘌呤核苷酸結合蛋白3(guanine nucleotide binding protein-like 3-like，Gnl3l)和新型核仁GTP酶(novel putative nucleolar GTPase1，Ngp-1)，實驗表明這3個家族成員在體內均與GTP結合，同時蛋白間GTP的結合域是一致的[8]。NS在C端含有一個酸性氨基酸域(AAA)，在N端含有一個堿性氨基酸域(BAA)和一個卷曲線圈域(CC)。后兩個結構域作為核仁蛋白的重要組成在動植物細胞周期中起著關鍵的作用[5]。然而與哺乳動物不同，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中只發現NS的兩個亞家族——類核干因子和類Ngp-1，沒有類Gnl3l[9]。

擬南芥的類核干因子(nucleostemin-like 1，NSN1)具有與哺乳動物NS基因相同的結構域，通過RNA原位雜交發現NSN1表達于植物莖尖分生組織和各種組織原基中；亞細胞定位發現，NSN1主要定位于核仁中[10-11]。在擬南芥和煙草(Nicotianabenthamiana)中均發現NSN1的沉默會導致生長的遲緩和衰老的提前，表明NSN1通過調節核糖體的生物發生從而調控植物生長和衰老的過程。已經發現NSN1可以與包括雌激素受體共調節因子抗體(pescadillo)和EB病毒核抗原1結合蛋白2(EBNA-binding protein 2，EBP2)在內的核糖體蛋白發生相互作用；而NSN1的缺失則可能通過延遲60 s核糖體亞基的生物發生來抑制翻譯過程[12-14]。擬南芥突變體nsn1在胚胎發生的過程中子葉發生畸變，同時葉片極性發生紊亂[15]。在苗期，nsn1的子葉和葉片向上卷曲，卷曲的葉片在近軸端生長出分生組織類似物的增生結構，同時在nsn1葉片的近軸端發現了比野生型植株遠軸端更長更大的鋪面細胞，說明NSN1的突變會導致分生組織和遠軸端細胞相關基因表達水平的上調，抑制了子葉邊界和遠軸端細胞識別相關基因的表達[9]。nsn1的葉片和根系均有發育缺陷，產生的營養器官數量嚴重減少，細胞數量遠少于野生型，暗示了NSN1是胚胎發育、子葉和葉片生長和發育所必需的基因[16-17]。

綜上所述，擬南芥的NSN1在植物細胞分化和細胞增殖調控中起到重要作用。蒺藜苜蓿是一種重要的一年生豆科模式植物，而NS在蒺藜苜蓿中的研究還尚未有人涉足。本研究通過克隆蒺藜苜蓿中NSN1的同源基因MtNSN1，分析該基因在不同組織中的表達水平差異，構建超表達載體并轉化野生擬南芥，利用實時熒光定量PCR檢測超表達植株中細胞周期標記基因的表達情況，以及使用DNA抑制劑博來霉素來檢測轉基因擬南芥對其耐受性的改變。旨在初探MtNSN1的表達模式及其對生長發育的調控作用，以期為苜蓿產量性狀的遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與培養

蒺藜苜蓿R108種子購于美國諾貝爾研究所，擬南芥Clombia-0種子保存于本實驗室。挑選健康飽滿的蒺藜苜蓿種子，在細砂紙上輕輕摩擦，破除種子硬實。將種子置于浸濕濾紙的玻璃皿中，放入光照培養箱(16 h光照/8 h黑暗，26 ℃/22 ℃，相對濕度60%)培養5 d左右。待種子萌發，將發芽的幼苗種在1/2霍格蘭營養液中，置于人工氣候室(20～22 ℃，16 h光照/8 h黑暗)中。每5 d換一次營養液，培養至取樣。將野生型擬南芥的種子用10%的次氯酸鈉浸泡10 min消毒，再用超純水沖洗10次。加入0.1%的瓊脂使種子懸浮，將其均勻地種在1/2 MS固體培養基上，置于4 ℃冰箱春化48 h，然后放在培養箱培養14 d左右，移入土中，置于人工氣候室培養。

1.2 蒺藜苜蓿MtNSN1的克隆

根據Ensembl Plant數據庫中同源基因NSN1的基因序列，用Primer 5設計一對引物MtNS-F/R(表1)。以蒺藜苜蓿R108的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得目的基因。將目的基因與pEASY-T5載體連接后，轉化到大腸桿菌Trans-T1感受態細胞中，涂布在含有卡那霉素(50 mg·L-1)抗性的固體LB培養基上，置于培養箱中37 ℃培養12 h，挑取長勢較好的單克隆菌株送公司測序，將測序結果正確的菌株提取質粒于-20 ℃保存。

1.3 生物信息學分析

利用DNAMAN軟件分析測序結果并獲得編碼蛋白序列，并比對不同物種中MtNSN1同源基因的氨基酸序列; 通過 MEGA 5.0 軟件進行進化樹分析；利用Expasy網站中的ProtParam預測蛋白等電點和分子量；用ProtScale進行蛋白親疏水性分析。運用PredictProtein網站進行亞細胞定位的預測；利用CBS網站中的TMHMM 2.0進行跨膜結構的預測；利用NPSA-PRABI網站對蛋白的二級結構進行分析。

1.4 MtNSN1的表達分析

取開花期蒺藜苜蓿的根、莖、葉和花分別提取RNA。以蒺藜苜蓿的actin2作為內參基因，根據基因序列設計熒光定量引物qPCR-F/R(表1)，用SYBR法進行實時熒光定量PCR。所得數據用2-ΔΔCT(Livak) 方法處理分析。

1.5 MtNSN1的RNA原位雜交

切取培養皿中萌發3 d的蒺藜苜蓿幼苗的莖尖部分，將其置于福爾馬林-乙酸-乙醇混合液(formalin-aceto-alcohol，FAA)中固定，用不同濃度的乙醇和二甲苯對材料進行脫水和透明處理，然后浸蠟包埋，再用切片機切片，最終獲得蒺藜苜蓿的莖尖石蠟切片。根據MtNSN1的序列設計一對片段長度約為200 bp的特異性良好的探針引物insitu-F/R(表1)，引物上下游分別加上具有T7和SP6 RNA聚合酶啟動子的序列。通過體外轉錄獲得正義和反義RNA探針。對探針RNA和對照RNA進行一定梯度稀釋后進行預雜交試驗，確定探針的濃度。對莖尖石蠟切片進行脫蠟，蛋白酶K消化以及脫水處理。用混有探針RNA的雜交液對切片進行雜交，然后洗片，顯色，封片，最后用熒光顯微鏡觀察[18-19]。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Sequences of primers used in the study

1.6 超表達載體pMDC83-MtNSN1的構建以及對擬南芥的轉化

以含有目的基因的質粒作為模板，設計一對去掉終止密碼子的引物p83-NSN1-F/R(表1)，PCR擴增出目的基因。將目的基因切膠回收純化后，通過入門載體與最終載體pMDC83連接。用熱激法[20]將載體轉化到大腸桿菌T1感受態中，篩選陽性菌株測序后，獲得超表達載體pMDC83-MtNSN1，然后提取菌株質粒。將上述質粒轉化到農桿菌GV3101中，活化后離心重懸，用花序侵染法[20]轉化野生型擬南芥。收獲轉化的擬南芥T1代種子，將其種于含有潮霉素(50 mg·L-1)抗性的1/2 MS固體培養基上，篩選抗性轉基因擬南芥。

1.7 轉基因擬南芥陽性植株的鑒定

以T1代抗性轉基因植株DNA為模板，用引物p83-NSN1-F/R(表1)進行PCR擴增，檢測陽性植株。以鑒定為陽性植株的cDNA為模板，用引物qPCR-F/R進行實時熒光定量PCR，以擬南芥β-actin(表1)為內參基因，每個處理設計3個生物學重復。所得數據用2-ΔΔCT(Livak) 方法分析。

1.8 MtNSN1基因的功能分析

1.8.1表型分析 將野生型擬南芥和MtNSN1表達量較高的陽性轉基因擬南芥T2代種子于光照培養箱培養2周。測量并統計植株的主根長度和葉片數量，每個株系設置50個重復。

1.8.2細胞周期標記基因的表達模式分析 根據對擬南芥的表型統計，綜合分析后選擇性狀差異最大并且MtNSN1表達量最高的株系NSN1-5來進行后續實驗。選取4周齡的T2代轉基因擬南芥提取植物總RNA，根據細胞周期標記基因包括3個細胞周期基因CYCA2;3、CYCB1;1、CYCD3;1和2個S期特有基因組蛋白H4基因(HistoneH4)和核糖核酸還原酶編碼基因(ribonucleotide reductase,RNR)的序列設計引物(表1)，以β-actin為內參基因，進行熒光定量PCR(方法同1.4)。

1.8.3對DNA抑制劑的耐受性分析 博來霉素是一種DNA抑制劑，用其處理植物會導致多種類型分子損傷的產生，包括DNA單鏈和雙鏈的斷裂，該抑制劑主要影響細胞周期的S期[21]。前人研究發現擬南芥在博來霉素的處理下，與細胞周期相關的基因均有所下調[22]。將野生型擬南芥和T2代轉基因擬南芥的種子消毒后置于4 ℃春化2 d，種在1/2 MS培養基上，豎直培養2周后，移在含有3，6，9和12 mg·L-14個濃度博來霉素抗性的1/2 MS培養基上，繼續培養1周，統計不同濃度下2個株系擬南芥的根長，不同處理各設置50個重復。

2 結果與分析

2.1 蒺藜苜蓿MtNSN1的生物信息學分析

MtNSN1是一個 cDNA全長2193 bp的基因，其中包含一個1800 bp的開放閱讀框，可編碼599個氨基酸。將該基因序列與數據庫(https://www.arabidopsis.org/Blast/index.jsp)中的A17生態型蒺藜苜蓿同源基因的序列進行比對，發現有8個堿基差異與3個氨基酸差異。

生物進化樹分析表明，MtNSN1與大豆(Glycinemax)的氨基酸同源性為66.67%(圖1)。利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對，發現其中G～G5組成的MMR/HSR1域，在古生菌到脊椎動物中都有存在(圖1)。采用Expasy網站中的ProtParam預測MtNSN1蛋白分子量為133.7 kDa，蛋白偏堿性。通過ProtScale對蛋白的疏水性分析表明MtNSN1為親水性蛋白。利用PredictProtein預測MtNSN1定位于細胞核上。采用TMHMM 2.0預測發現該蛋白無跨膜區。利用NPSA-PRABI網站分析知MtNSN1的二級結構主要由44.57%的α螺旋和41.57%的無規則卷曲組成。

2.2 MtNSN1的組織差異性表達分析

利用熒光定量PCR對蒺藜苜蓿的根、莖、葉和花中的MtNSN1進行定量分析，結果表明，該基因在這些組織中均有表達。其中MtNSN1在花中表達量最高，根次之，表達量約為花中的30%；葉中表達量最低，僅為花中的10%(圖2)。

2.3 MtNSN1在蒺藜苜蓿莖尖的原位雜交

反義探針在莖尖分生組織中檢測到陽性信號，顯示出藍紫色(圖3A)， 而正義探針未檢測到陽性信號，沒有顯示出藍紫色(圖3B)。表明MtNSN1主要表達在生長活躍的莖尖分生組織和周圍的幼嫩葉中。

2.4 陽性轉基因擬南芥的篩選與鑒定

在含有潮霉素(50 mg·L-1)抗性的1/2 MS固體培養基上篩選出7株抗性轉基因擬南芥植株。經過PCR檢測確定以上植株均為陽性轉基因植株。實時熒光定量PCR結果表明，MtNSN1在不同株系中表達量不同。將7株陽性苗分別命名為NSN1-1、NSN1-2、NSN1-3、NSN1-4、NSN1-5、NSN1-6、NSN1-7。其中NSN1-6中MtNSN1表達量最低；NSN1-5中表達量最高，是NSN1-6的65倍；NSN1-3表達量次之，是NSN1-6的9倍(圖4)。

圖1 MtNSN1與其他物種生物進化樹分析和氨基酸序列多重比對Fig.1 Phylogenetic analysis and amino acid sequence alignment of MtNSN1 with other species A:MtNSN1與其他物種的系統進化樹分析(方框內為蒺藜苜蓿的MtNSN1)； B:MtNSN1與其他物種的氨基酸序列比對(方框內為保守結構域G1～G5)。A:Phylogenetic analysis of MtNSN1 with other species (The frame shows MtNSN1 in M. truncatula); B:Amino acid sequence alignment of MtNSN1 with other species (The frame shows conserved domain of G1-G5).ZmGNL: 玉米 Zea mays NP_001142481; VaGNL: 紅豆 Vigna angularis XM_017584230.1; MtNGP: 蒺藜苜蓿 M. truncatula XP_013467257.1; NGP: 擬南芥 Arabidopsis NP_175706.1; MmGNL3: 小鼠 Mus musculus AY181025.1; HsGNL3: 人 Homo sapiens AAV74413.1; SrGNL3: 線蟲 Strongyloides ratti XP_024506722.1; OsNSN1: 水稻 Oryza sativa XP_015620869.1; MtNSN1: 蒺藜苜蓿 M. truncatula XP_013467257.1; GmNSN1: 大豆 Glycine max KRG90185; LaNSN1: 狹葉羽扇豆 Lupinus angustifolius XM_019580035.1; NSN1: 擬南芥 Arabidopsis NP_187361.1; NaNSN1_0: 煙草 Nicotiana attenuate XP_019249461; SlNSN1: 番茄 Solanum lycopersicum NP_001234382; SbNSN1: 高粱 Sorghum bicolor XP_002464274.

2.5 轉基因擬南芥的表型分析

根據對野生型擬南芥以及轉基因擬南芥NSN1-2，NSN1-3和NSN1-5的2周齡植株根長和葉片數量的統計，3個株系的轉基因擬南芥根長明顯多于野生型擬南芥，其中平均根長最長的是NSN1-3，比野生型擬南芥長大約2 cm(圖5)；3個株系的轉基因擬南芥葉片數量略多于野生型擬南芥，但無顯著差異。其中平均葉片數量最多的是NSN1-5(圖5)，比野生型擬南芥多1～2片。統計結果表明，MtNSN1轉基因擬南芥的主根長度和葉片數量均優于野生型擬南芥。

2.6 轉基因擬南芥中細胞周期標記基因的表達分析

圖2 蒺藜苜蓿中MtNSN1的組織差異性表達分析Fig.2 The relative expression of MtNSN1 in different organizations from M. truncatula不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。Different small letters mean significant differences (P<0.05), the same below.

通過實時熒光定量PCR，分析WT和轉基因擬南芥T2代中5個細胞周期標記基因的表達量。結果表明，在轉基因擬南芥中5個細胞周期標記基因表達量都有不同程度的升高。其中CYCA2;1表達量升高顯著(圖6)，是野生型擬南芥的70倍；CYCD3;1和H4表達量次之，是野生型擬南芥的2.5倍多；CYCB1;1和RNR表達量升高較少，是野生型擬南芥的2倍。

2.7 DNA抑制劑對轉基因擬南芥生長發育的影響

轉基因株系和WT在博來霉素濃度從低到高的處理下，根長越來越短，說明博來霉素對擬南芥的生長有抑制作用。在同一濃度下比較，轉基因擬南芥的根長均長于WT，表明MtNSN1轉基因擬南芥比野生型擬南芥對博來霉素有更強的耐受性(圖7)。

圖3 MtNSN1在蒺藜苜蓿莖尖分生組織的原位雜交定位Fig.3 The localization of MtNSN1 examined in shoot apical meristem of M. truncatula by in situ hybridization A: 反義探針雜交結果Hybridized with the MtNSN1 antisense RNA probe; B: 正義探針雜交結果Hybridized with the MtNSN1 sense RNA probe; SAM: 莖尖分生組織Shoot apical meristem; P1，P2: 葉原基發育的不同時期The different times of leaf primordium; 標尺為50 μm The bar is 50 μm.

3 討論

圖4 轉基因擬南芥中MtNSN1的相對表達量Fig.4 The relative expression level of MtNSN1 in transgenic Arabidopsis

蒺藜苜蓿MtNSN1包含一個1800 bp的開放閱讀框，可編碼599個氨基酸，蛋白分子量為133.7 kDa，蛋白偏堿性。根據進化樹分析，MtNSN1與大豆親緣關系最近。氨基酸多序列比對分析發現，蛋白由5個保守的GTP結合基序組成，分別為G1、G2、G3、G4和G5[23]，這樣的結構被命名為MMR/HSR1結構域。

MtNSN1在蒺藜苜蓿不同組織中的表達量也有所不同，其中在花中的表達量最高。Wang等[11]的研究表明， 擬南芥NSN1通過直接或間接控制結合到隱花基因2(AGAMOUS2，AG2)上的引物蛋白復合物來調控隱花基因(AGAMOUS，AG)。在植物中，干細胞的活動必須通過花的發育過程來終止，而這一過程需要激活AG的表達，因此AG在花分生組織起始過程中發揮著重要作用[24-25]。這與NSN1編碼的mRNA主要分布于花序分生組織和花原基中，以及該基因對花的生長發育起到重要調控作用這一結論具有一致性。

圖5 轉基因和野生型擬南芥的表型統計Fig.5 The phenotype statistics of transgenic Arabidopsis and WT

圖6 5個細胞周期標記基因在轉基因擬南芥中的相對表達量Fig.6 The relative expression level of five cell cycling marker genes in transgenic Arabidopsis

圖7 不同濃度博來霉素處理下轉基因和野生型擬南芥的根長 Fig.7 The root length statistics of transgenic and WT Arabidopsis under different concentration of bleomycin

通過RNA原位雜交，發現NSN1在幼苗葉片和莖尖分生組織中有明顯的信號，表明NSN1在擬南芥參與生長發育的過程[9]。本研究利用原位雜交發現MtNSN1在蒺藜苜蓿的莖尖分生組織及其周圍幼嫩的葉中表達，表明該基因表達于具有衍化出各類組織原基功能的莖尖分生組織中，表明蒺藜苜蓿MtNSN1參與了分生組織的調控機制。

通過研究NSN1對擬南芥子葉發育的影響表明，該基因的突變可能對胚胎發育的任何階段產生抑制作用。進一步研究證明NSN1參與分生組織在胚胎中的發生過程以及控制子葉的發育[9]。Jeon等[12]研究發現NbNSN1缺失的煙草植株有生長遲緩的現象。本研究通過統計發現MtNSN1轉基因擬南芥在主根長度和葉片數量上與野生型相比都有增加，表明該基因可能影響植物胚胎及不同器官的生長發育。

有文獻報道[2,13]，在動物中缺失或超表達NS時細胞周期會被抑制，同時G1-S和G2-M的過渡階段也發生阻滯。在體外培養的神經干細胞中，NS的缺失會抑制DNA的復制過程，同時擾亂DNA的自我更新，而超表達NS則對羥化導致的DNA損傷具有保護作用[26]。研究發現，核糖體生物發生是細胞周期進展的關鍵調控機制，G1期結束產生的核糖體數量控制著G1的S期的轉變[27]。本研究通過DNA抑制劑博來霉素處理不同的擬南芥株系，發現MtNSN1轉基因擬南芥植株的主根比野生型擬南芥更長，表明轉基因株系對博來霉素有更強的耐受性，這種耐受性的提高可能是MtNSN1參與了細胞周期的調控造成的。

此外，有研究發現擬南芥NSN1通過維持細胞周期的進程參與調控植物的生長發育[28]。Wang等[16]的研究中發現擬南芥突變體nsn1表型矮小，且NSN1主要定位于控制細胞生長的核仁中。細胞周期標記基因CYCA2;3、CYCB1;1、CYCD3;1、RNR和H4除了控制細胞周期過渡外，還在植物細胞分裂和分化發育過程中起著協調作用[29]。在nsn1突變體中，細胞周期標記基因的表達量與野生型擬南芥相比均有所下降[16]。本研究發現MtNSN1轉基因擬南芥中上述5種細胞周期標記基因的表達量與野生型擬南芥相比均有上調，表明MtNSN1在轉錄水平上影響擬南芥的細胞周期進程。

4 結論

克隆得到蒺藜苜蓿MtNSN1 的cDNA全長2193 bp，氨基酸序列比對表明MtNSN1含有MMR/HSR1結構域，屬于GTPase家族中的RbgA/YlqF/YawG 亞家族。通過對MtNSN1在蒺藜苜蓿不同器官中的表達分析，表明該基因在花中表達量最高，根次之，葉片中表達量最低，僅為花中的10%；RNA組織原位雜交顯示，MtNSN1主要在莖尖分生組織及其周圍的幼嫩葉中表達，暗示MtNSN1與苜蓿莖尖分生組織維持有關。超表達MtNSN1擬南芥的主根長度和葉片數目都明顯優于野生型，初步說明該基因影響地上及地下器官的生長。通過實時熒光定量PCR分析表明，超表達MtNSN1擬南芥中細胞周期標記基因CYCA2;3、CYCB1;1、CYCD3;1、H4和RNR的表達水平均有顯著上調。DNA化學誘變劑處理后，超表達植株根系受抑制程度小于野生型，表明MtNSN1參與維持細胞周期的過程。