海葵基底附生酵母的分離鑒定與乙醇發(fā)酵效率研究

張本旭 ，于紅霞 ，李夏云，邢 翔

（1.山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東威海 264209；2.山東頤陽(yáng)集團(tuán)，山東威海 264400）

隨著石化資源的枯竭，人們的環(huán)保意識(shí)不斷增強(qiáng)。乙醇被譽(yù)為可再生綠色能源燃料，由于其燃燒污染小、容易運(yùn)輸和貯藏，在價(jià)格上乙醇也可與汽油相競(jìng)爭(zhēng)，因此具有巨大的開(kāi)發(fā)前景。目前我們的工業(yè)釀酒酵母菌大都來(lái)自于陸地環(huán)境。2000 年出版的《YEASTS，Characteristics and Identification，Third Edition》中，Barnett 等人描述了678 種酵母菌，其中51 種來(lái)自海洋環(huán)境。海洋占整個(gè)地球面積的70%，其中有豐富的生物資源，包括酵母菌和酵母菌基因資源[1]。

近些年來(lái)研究表明，海洋微生物可與多種海洋無(wú)脊椎動(dòng)物形成共附生關(guān)系而且可能是某些天然產(chǎn)物最初的合成者[2]。海葵分布廣泛，從潮間帶到深淵海底、從熱帶水域到兩極海域的多種海洋環(huán)境中（包括海底熱液和冷泉）都有它們的蹤跡，而且在一些海域中生物量很大，為優(yōu)勢(shì)種[3]。與海葵形成共附生關(guān)系的部分海洋酵母種類具有發(fā)酵乙醇的功能，由于海洋的高滲環(huán)境，海洋酵母菌與淡水酵母菌相比有耐鹽性好、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)從海葵附著層中獲得的4 株酵母菌的發(fā)酵性能進(jìn)行比較，并選取發(fā)酵性能較好、有較大提升潛力的1 株酵母菌，優(yōu)化其發(fā)酵條件，通過(guò)正交試驗(yàn)找到最優(yōu)發(fā)酵條件，以提升酵母菌的發(fā)酵效率。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：本實(shí)驗(yàn)從黃海、渤海海域麻子港（37.534014，122.066834），南山咀（37.522151，122.163179）中采集到若干株海葵及附著層樣本，分離篩選獲得4 株海洋酵母菌。在試驗(yàn)中分別命名為S4、ZE、DB、A1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定[4]

取20 個(gè)100 mL 三角瓶分別裝入30 mL 的YPD液體培養(yǎng)基，滅菌后編號(hào)其中一個(gè)標(biāo)注為空白對(duì)照，以0.5%的接種量接種，置于28 ℃，120 r/min的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔4 h取出三角瓶，測(cè)定該瓶中的菌懸液OD值[5]。

按照空白對(duì)照調(diào)節(jié)分光光度計(jì)0 位，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定酵母菌不同生長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)液的OD600值，測(cè)定3 次取其平均值。若菌懸液濃度太高，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)稀釋使OD 值在0.1～0.8 之間，并記錄相應(yīng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)時(shí)間、稀釋倍數(shù)、OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 酵母菌發(fā)酵性能測(cè)定

1.2.2.1 CO2釋放量測(cè)定實(shí)驗(yàn)

酵母菌在無(wú)氧條件下通過(guò)呼吸作用，將糖類轉(zhuǎn)化為乙醇，并放出二氧化碳，以上過(guò)程可表示為。由此式可知，通過(guò)記錄發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CO2含量可計(jì)算發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的含量，繼而表征發(fā)酵效率。

配制100 mL YPD 發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%的接種量接入種子液，同時(shí)將未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照，稱重后放入搖床培養(yǎng)箱中，在28 ℃、120 r/min的條件下培養(yǎng)。發(fā)酵過(guò)程中每隔24 h 取出稱重，直至發(fā)酵液前后質(zhì)量差與對(duì)照組質(zhì)量差相當(dāng)，即認(rèn)為發(fā)酵終止。計(jì)算排氣前后重量差，即CO2釋放量。由方程式計(jì)算可知，CO2釋放量∶乙醇=22∶23，可間接計(jì)算出乙醇產(chǎn)生量。

1.2.2.2 發(fā)酵液酒精度測(cè)定（酒精計(jì)法）

將發(fā)酵完成的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至500 mL 蒸餾瓶中，加入50 mL 蒸餾水，用減壓蒸餾裝置蒸餾出100 mL 溶液，用酒精比重計(jì)測(cè)定所得溶液的乙醇度，以及溶液溫度，換算得20 ℃時(shí)的酒精度。1.2.2.3 發(fā)酵液酒精度測(cè)定（重鉻酸鉀比色法）

酒精計(jì)法測(cè)定乙醇含量較為粗略，故選用重鉻酸鉀比色法來(lái)精確測(cè)定樣品中的乙醇濃度，此方法通過(guò)乙醇在酸性條件下與重鉻酸鉀反應(yīng)生成三價(jià)鉻離子（Cr3+），鉻離子在600 nm 處有吸收峰，可利用吸光度值計(jì)算溶液中的乙醇含量。公式：

重鉻酸鉀比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取0.2 g 無(wú)水乙醇加入100 mL 容量瓶中配制為體積分?jǐn)?shù)為0.25%的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，由乙醇密度計(jì)算得每毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液中有約2.0 mg乙醇。另取5 g重鉻酸鉀溶于蒸餾水中，加入10 mL 濃硫酸放置至室溫后加蒸餾水定容至100 mL，得到5 %重鉻酸鉀酸性溶液。分別向1～8號(hào)試管中加入乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0～7.0 mL后，加入2.0 mL 的5 %重鉻酸鉀酸性溶液，最終定容至10 mL。將準(zhǔn)備好的試管放置于沸水浴中加熱反應(yīng)10 min，取出并冷卻至室溫，將1號(hào)管作為空白對(duì)照將分光光度計(jì)調(diào)零，其余試管于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度，每組重復(fù)一次取平均值，以乙醇濃度與對(duì)應(yīng)的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

發(fā)酵液樣品乙醇含量測(cè)定：取蒸餾后產(chǎn)物0.25 mL 于試管中，加入2.0 mL 的5 %重鉻酸鉀酸性溶液，加水定容至10 mL，沸水浴加熱10 min 后冷卻至室溫，于波長(zhǎng)600 nm 處測(cè)定吸光度，每組樣品平行測(cè)定3 次求平均值，后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品中的乙醇含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)[7]

通過(guò)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和發(fā)酵性能的測(cè)定，選取生長(zhǎng)狀況較好、發(fā)酵性能較優(yōu)的1 株酵母菌ZE，對(duì)影響其發(fā)酵效率的因素進(jìn)行單因素條件優(yōu)化。

1.2.3.1 發(fā)酵溫度的影響

菌種活化后，按照體積分?jǐn)?shù)10.0%的接種量接種5 瓶YPD 發(fā)酵培養(yǎng)基，分別將其放置于25～38 ℃5 個(gè)發(fā)酵溫度下，以120 r/min 搖床培養(yǎng)24 h，每個(gè)溫度梯度做1 次平行。記錄發(fā)酵前后錐形瓶重量變化，計(jì)算CO2釋放量及乙醇產(chǎn)生量。

1.2.3.2 發(fā)酵碳源的影響

將葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、阿拉伯糖、半乳糖以2%的濃度分別加入基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基中配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，并裝液于帶杜氏管的試管中。將活化后的菌液以1 %的接種量接種于試管中培養(yǎng)24 h，每組重復(fù)兩次，記錄杜氏管中產(chǎn)氣情況。

1.2.3.3 發(fā)酵氮源的影響

將培養(yǎng)基中的氮源分別替換為硫酸銨、硝酸鉀、尿素、蛋白胨、酵母粉以制備不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基。菌種活化后，將它們以10.0%的體積分?jǐn)?shù)接種，并置于28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。記錄發(fā)酵前后錐形瓶重量變化，并計(jì)算CO2排放量及乙醇產(chǎn)生量。

1.2.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基pH值的影響

調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液pH4.5～6.5。菌種活化后，將其以10.0%的體積分?jǐn)?shù)接種，置于28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組做1 次重復(fù)。記錄發(fā)酵前后錐形瓶重量變化，計(jì)算CO2釋放量及乙醇產(chǎn)生量。

1.2.3.5 發(fā)酵氮源濃度的影響

根據(jù)氮源實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最適氮源，制備氮源濃度分別為1 %～5 %的發(fā)酵培養(yǎng)基。菌株活化后，將它們以10.0 %的體積分?jǐn)?shù)接種，并置于28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。記錄發(fā)酵前后錐形瓶重量變化，計(jì)算CO2排放量及乙醇產(chǎn)生量。

1.2.3.6 發(fā)酵碳源濃度的影響

根據(jù)碳源發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最適的碳源，配制碳源濃度分別為16%～28%的發(fā)酵培養(yǎng)基。菌種活化后，將它們以10.0 %體積分?jǐn)?shù)接種，置于28 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組做1次平行。記錄發(fā)酵前后錐形瓶重量變化，計(jì)算CO2釋放量及乙醇產(chǎn)生量。

1.2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵溫度、氮源濃度、發(fā)酵液pH 值3 個(gè)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量有明顯影響的因素，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的正交試驗(yàn)，采用L9(34)的正交表對(duì)酵母菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[8]，見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)(一)

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定OD600（圖1）

圖1 4種酵母菌的生長(zhǎng)曲線

由圖1 可知，對(duì)于菌株A1，在培養(yǎng)0～4 h 為延滯期，4～28 h 為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，28～72 h 為穩(wěn)定期，在試驗(yàn)階段中未觀測(cè)到衰亡期。對(duì)于菌株ZE、S4、DB，在培養(yǎng)0～8 h 為延滯期，8～42 h 為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，42～72 h 為穩(wěn)定期，未見(jiàn)明顯衰亡期。菌株DB、S4、ZE 相比菌株A1 在達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的菌種數(shù)量占有明顯的優(yōu)勢(shì)。

2.2 CO2釋放量測(cè)定（圖2）

圖2 CO2釋放量變化曲線

由圖2 可知，4 種酵母菌的CO2釋放量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，即在發(fā)酵的前24 h 時(shí)，發(fā)酵效率最大，隨后產(chǎn)生的CO2含量減少，即單位時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇含量減少。可推斷由于發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇在發(fā)酵液中積累，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中的乙醇濃度逐漸升高，而乙醇濃度的升高會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)及其發(fā)酵過(guò)程，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的CO2釋放量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，因此在后續(xù)試驗(yàn)中選取前24 h 的CO2釋放量作為發(fā)酵效率高低的比較指標(biāo)。

在發(fā)酵開(kāi)始后7 d，A1 和ZE 菌株的CO2釋放量接近0 g，在發(fā)酵開(kāi)始后10 d的S4和DB菌株的CO2釋放量接近0 g，其微小的數(shù)值可能為搖瓶時(shí)的水蒸汽蒸發(fā)所致，因此可推斷A1 與ZE 在發(fā)酵后第7天、S4 與DB 在發(fā)酵后第10 天，錐形瓶重量基本不發(fā)生變化，判定認(rèn)為發(fā)酵完成。

由圖2 可知，CO2日釋放量在發(fā)酵開(kāi)始后5 d 時(shí)間 內(nèi)ZE＞A1＞DB＞S4，之 后 有S4＞DB＞ZE=A1。另將每24 h 的CO2釋放量相加可得CO2總釋放量，其中ZE 在發(fā)酵過(guò)程中共釋放CO244.1 g、A1共釋放CO236.2 g、S4 共釋放CO231.0 g、DB 共釋放CO232.1 g，ZE 在發(fā)酵過(guò)程中釋放的CO2明顯高于其他3株酵母菌。

2.3 乙醇含量測(cè)定

由實(shí)驗(yàn)測(cè)得每組試管中的乙醇含量及其在600 nm波長(zhǎng)處的OD600值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖3。

圖3 分光光度法測(cè)定乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3結(jié)果表明，反應(yīng)中乙醇濃度在0～14 mg/10 mL范圍內(nèi)，乙醇濃度與相應(yīng)的OD600呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.0512x，其相關(guān)系數(shù)R2為0.9948。將測(cè)量所得樣品OD600取平均值后計(jì)算得到相應(yīng)的乙醇含量A，換算成20 ℃的酒精度X，按下式計(jì)算：

式中：X為酒精度（100 mL溶液中所含的乙醇體積數(shù)）；A 為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得樣品中乙醇含量（mg）；V 為取酒樣體積（mL）；ρ乙醇為20 ℃時(shí)乙醇密度（g/mL）。

圖4 4種酵母菌的發(fā)酵液酒精度測(cè)定值

相比較酒精計(jì)測(cè)量蒸餾液酒精度和重鉻酸鉀分光光度法測(cè)量酒精度法，兩種方法所測(cè)得數(shù)值稍有偏差（圖4），可能由于酒精計(jì)測(cè)量的誤差大導(dǎo)致。但從數(shù)據(jù)趨勢(shì)來(lái)看，均有ZE＞S4＞DB＞A1，其中ZE 在發(fā)酵完成時(shí)的酒精度為3.676 %vol，明顯高于其他3 種酵母菌，可判斷在28 ℃、120 r/min培養(yǎng)條件下ZE 發(fā)酵乙醇效率較高。結(jié)合生長(zhǎng)曲線以及CO2釋放實(shí)驗(yàn)，選取生長(zhǎng)狀況較好、發(fā)酵產(chǎn)量較高的ZE 菌株進(jìn)行其發(fā)酵條件的優(yōu)化選擇、以找到發(fā)酵的最優(yōu)條件搭配。

2.4 單因素條件優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效率的影響（圖5）

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)ZE發(fā)酵效率的影響

溫度是菌內(nèi)酶反應(yīng)的速度以及菌體生長(zhǎng)速度的重要影響因素。由圖5 可知，溫度對(duì)于菌種發(fā)酵產(chǎn)率有明顯的影響，當(dāng)發(fā)酵溫度為33 ℃時(shí)，CO2釋放量最高，且相較其他溫度差異顯著，可推斷菌種在25～38 ℃溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵效率先升高后下降，在33 ℃附近達(dá)到峰值，因此選擇33 ℃作為最優(yōu)發(fā)酵溫度。

2.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源對(duì)發(fā)酵效率的影響（圖6）

圖6 氮源種類對(duì)ZE發(fā)酵效率的影響

氮源是酵母菌合成自身所需蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)的重要原材料，不同的氮源對(duì)微生物有不同的生理學(xué)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)測(cè)試了6 種不同氮源進(jìn)行發(fā)酵，其中硫酸銨、硝酸鉀、尿素為無(wú)機(jī)氮源，蛋白胨、酵母浸粉以及兩者以2∶1 的配比混合所得的混合氮源為有機(jī)氮源。由圖6 數(shù)據(jù)可知，菌種對(duì)蛋白胨和酵母浸粉以及兩者的混合氮源即3 種有機(jī)氮源較為適應(yīng)，有較高的CO2釋放量即較高的發(fā)酵產(chǎn)量，相較硫酸銨、硝酸鉀和尿素有明顯差異。當(dāng)采用混合氮源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，CO2釋放量最高，但相較其他兩種單一氮源差異不明顯。

圖7 氮源濃度對(duì)ZE發(fā)酵效率的影響

由圖7 可知，隨著氮源濃度逐漸增加，CO2釋放量先增加后減少，在氮源濃度為3 %時(shí)達(dá)到最大，相較其他濃度下的釋放量差異明顯，因此選擇3%的氮源濃度且為蛋白胨∶酵母浸粉為2∶1 的混合氮源作為最優(yōu)氮源進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源對(duì)發(fā)酵效率的影響

碳源是指微生物生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)源，為微生物提供所需的碳元素，由于不同微生物所產(chǎn)生酶系不同，因此利用不同碳源的程度也存在差異[9]。通過(guò)糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)可得，在杜氏管中產(chǎn)生氣泡的僅葡萄糖，蔗糖、乳糖、甘露糖、半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖杜氏管中均無(wú)氣泡。未產(chǎn)生氣泡的幾組實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，該菌種可能缺少利用此類糖類的酶系，無(wú)法在該培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生乙醇并放出CO2，實(shí)驗(yàn)中菌種可利用的碳源僅為葡萄糖，均無(wú)法將其他碳源轉(zhuǎn)化為乙醇。將碳源濃度設(shè)置為16 %～28 %，再測(cè)量每組減重。

由圖8 可知，當(dāng)碳源濃度在22 %以下時(shí)，該菌種的CO2釋放量相近無(wú)明顯差異，當(dāng)碳源濃度達(dá)24 %時(shí)，CO2釋放量有所下降，當(dāng)碳源濃度上升至26%、28%時(shí)，該菌種CO2釋放量顯著降低，發(fā)酵效率下降。碳源濃度增高意味著培養(yǎng)液黏度增大、滲透壓增高、培養(yǎng)液中氧含量下降等物理變化，可能會(huì)影響到酵母菌的生長(zhǎng)以及發(fā)酵效率，因此過(guò)高的

圖8 碳源濃度對(duì)ZE發(fā)酵效率的影響

碳源濃度會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵效率下降。而碳源濃度在22 %以下時(shí)，未對(duì)菌種的生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)生明顯影響，而碳源作為發(fā)酵過(guò)程的底物在濃度未影響酵母菌生長(zhǎng)及發(fā)酵時(shí)，底物濃度越大，則底物質(zhì)量越大，在一定范圍內(nèi)能夠使菌種發(fā)酵完全，因此選擇碳源為葡萄糖，濃度為20%進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 值對(duì)發(fā)酵效率的影響（見(jiàn)圖9）

圖9 發(fā)酵液初始pH值對(duì)ZE發(fā)酵效率的影響

發(fā)酵液的pH 值會(huì)對(duì)酵母的生命活動(dòng)及酶的活性產(chǎn)生影響，酵母菌的適宜生長(zhǎng)條件為弱酸性，pH值過(guò)低會(huì)增加酵母細(xì)胞排除質(zhì)子的能量消耗并降低酵母細(xì)胞活度以及酵母對(duì)基質(zhì)的利用速率[7]。從圖9 可知，隨著發(fā)酵液初始pH 值的升高，CO2釋放量即發(fā)酵效率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH 值為5.5 時(shí)，發(fā)酵效率最高，因此選取pH5.5 進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.5 酵母菌發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果（表2）

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2，發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH值、氮源濃度3 個(gè)因素對(duì)CO2釋放量的影響數(shù)值R 可判斷各因素對(duì)發(fā)酵效率的影響主次順序?yàn)锳＞C＞B，即發(fā)酵溫度＞氮源濃度＞發(fā)酵液pH 值。較優(yōu)因素組合為A3B2C1即發(fā)酵溫度為38 ℃，發(fā)酵液pH值為5.0，氮源濃度為2%，理論最優(yōu)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)一致。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)鑒定，4 株菌株分別為A1：Hanseniaspora pseudoguilliermondi；S4、ZE：[Candida]duobushaemulonis；DB：Sporobolomyces carnicolor。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)從海葵著生層中分離出4 株酵母菌，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線。并對(duì)4 株菌進(jìn)行發(fā)酵性能的簡(jiǎn)單測(cè)定，選取生長(zhǎng)狀況較好、發(fā)酵產(chǎn)量較高的ZE 菌株進(jìn)行其發(fā)酵條件的優(yōu)化選擇。對(duì)其從溫度、pH、氮源、碳源等因素進(jìn)行優(yōu)化。最終選取發(fā)酵溫度、氮源濃度、發(fā)酵液pH 值3 個(gè)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量有明顯影響的因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)菌株在發(fā)酵溫度為38 ℃、發(fā)酵液pH 為5.0、氮源濃度為2 %，葡萄糖濃度為20 %時(shí)，乙醇發(fā)酵效率較高，24 h CO2釋放量為1.826 g。上述發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵7 d 至發(fā)酵終止，蒸餾發(fā)酵液采用重鉻酸鉀分光光度法測(cè)定發(fā)酵液酒精度為4.056%vol，相比原發(fā)酵配方酒精度提高了10.3%。

ZE 菌株在發(fā)酵溫度為38 ℃、發(fā)酵液pH5.0、氮源濃度為2 %，葡萄糖濃度為20 %時(shí)，發(fā)酵液乙醇濃度可達(dá)到4.056 %vol，具有良好的乙醇發(fā)酵能力。鄭虹、杜可[10]在其對(duì)高產(chǎn)乙醇的酵母發(fā)酵特性研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖初始濃度為200 g/L，用于研究的菌株的生物量和乙醇度達(dá)到最大值，菌株的生物量在2.0 左右，而乙醇產(chǎn)量在8.5%左右；Oshoma[11]在其研究中，酵母對(duì)氮的最適利用濃度為0.80 gN/L，并且硫酸銨為最適氮源；Mbajiuka[12]在發(fā)酵蔗糖實(shí)驗(yàn)中測(cè)定所用酵母菌最適初始溫度25 ℃、24 °Bx、pH 值4.0 時(shí)，發(fā)酵后酒精度達(dá)到10.5 %vol；而張莉、張?zhí)m[13]在其研究中也得到相似的結(jié)論，這與本實(shí)驗(yàn)中酵母的最適發(fā)酵條件有較大差別，推測(cè)是由于酵母菌的種類不同，其最適發(fā)酵條件也有所改變；鄧永東，李靜紅[14]在對(duì)1株熱帶假絲酵母菌發(fā)酵條件的研究中，其為發(fā)酵時(shí)間72 h，發(fā)酵溫度36 ℃，初始pH4，葡萄糖乙醇發(fā)酵理論得率為0.51 g 乙醇/g 葡萄糖，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論接近。通過(guò)與其他實(shí)驗(yàn)室的研究證明了本實(shí)驗(yàn)的菌株有良好的發(fā)酵乙醇的能力。該菌種來(lái)源于海洋環(huán)境下分離得到的野生菌種、在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中還可對(duì)其進(jìn)行遺傳改造進(jìn)一步提高其乙醇發(fā)酵能力，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。