紫草素對心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究①

白文偉 楊 華 劉小永 黃晶晶

(昆明醫科大學第二附屬醫院心內科，昆明650101)

缺血性心臟病是造成死亡和殘疾的主要原因之一。對于急性心肌梗死患者，限制心肌梗死最有效的治療方法是及時再灌注。但是，除了急性心肌缺血引起的損傷外，再灌注過程本身也可引起心肌損傷，即缺血再灌注(Ischemia reperfusion,I/R)損傷。然而，目前還沒有有效的治療方法來預防這種損傷，因此尋找新的治療方法來保護心臟不受缺血再灌注損傷的影響對于人類的醫療健康事業的發展具有重要意義[1]。越來越多的研究表明許多植物提取物在治療心肌缺血再灌注損傷方面發揮著積極作用，如黃芪多糖，羅布麻葉提取物，淫羊藿苷等[2-4]。紫草是一種傳統草藥，主要用于治療HIV-1感染。紫草素(Shikonin,Shi)是從紫草中分離出來的活性成分。大量數據顯示紫草素具有抗血管生成、抗炎癥、抗糖酵解等活性[5]。紫草素在癌癥、骨關節炎、肥厚性疤痕和子宮內膜異位等疾病治療中發揮著積極作用[6-9]。但紫草素在缺血再灌注損傷中的作用還尚不清楚。本研究的主要目的是探索紫草素對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 10～12周齡的小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司。紫草素(HPLC≥98%)和PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002購自Sigma公司，溶解于DMSO中。蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色液購自Solarbio。天冬氨酸轉氨酶(Aspart-ate transaminase,AST)和乳酸鹽脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。肌酸激酶(Creatine kinase-MB,CK-MB)和心肌肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac troponinⅠ,cTnⅠ)檢測試劑盒購自默沙克公司。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究院。白細胞介素(Interleukin,IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒來自默沙克公司。抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗caspase-3抗體、抗caspase-9抗體、抗PI3K抗體、抗p-AKT抗體、抗AKT抗體、抗p-mTOR抗體和抗mTOR抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 隨機將小鼠分為5組:對照組(Ctrl)；I/R模型組(I/R)；紫草素處理組(I/R+Shi)(12.5、25、50 mg/kg)。紫草素處理組在進行手術前3 d每天灌胃紫草素(12.5、25、50 mg/kg)，第4天時進行阻斷左冠狀動脈分支30 min，然后開放左冠狀動脈以實現24 h的再灌注。I/R模型組進行手術前3 d則用生理鹽水代替紫草素進行處理，第4天時進行阻斷左冠狀動脈分支30 min，然后開放左冠狀動脈以實現24 h的再灌注。對照組進行手術前3 d則用生理鹽水代替紫草素進行處理，第4天時進行手術但不阻斷左冠狀動脈分支。為分析PI3K/AKT信號通路在紫草素影響心肌缺血再灌注損傷小鼠中的作用，用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002(5 mg/kg)和紫草素(50 mg/kg)單獨或同時處理心肌缺血再灌注損傷小鼠。再灌注后檢測心肌梗死面積。

1.2.2 心肌損傷標記物檢測 再灌注后采集頸動脈血液，室溫放置30 min，離心3 000 r/min，15 min，收集血清。按照AST、LDH、CK-MB和cTnⅠ檢測試劑盒說明書對血清中AST、LDH、CK-MB和cTnⅠ的含量進行檢測。

1.2.3 HE染色觀察心肌組織病變 再灌注后取出心肌組織，首先PBS漂洗后于4%多聚甲醛、4℃固定24 h。再PBS清洗3次，30%、50%和70%的酒精依次脫水，每次10 min。然后于脫水機中進行脫水，石蠟包埋后再切片。最后按照HE染色液操作說明進行染色，顯微鏡下觀察心肌組織病變情況。

1.2.4 TUNEL檢測心肌組織細胞凋亡 石蠟切片首先進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，再用蛋白酶K于20～37℃孵育15～30 min。PBS漂洗3次后，3%的H2O2于室溫孵育20 min。然后依照試劑盒說明書進行生物素標記、顯色、蘇木素復染，再用自來水沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。最后顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 蛋白印跡檢測Bax、Bcl-2、caspase-3、casp-ase-9、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR的蛋白水平 心肌組織冰上勻漿后，4℃、4 200 r/min離心10 min,取上清。等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，再轉至PVDF膜，5%的BSA封閉1 h后加入相應的一抗，4℃過夜孵育。然后再加入HRP標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照，并統計灰度值計算相對表達量。

1.2.6 氧化應激指標檢測 首先心肌組織冰上勻漿后，4℃、4 200 r/min離心10 min,收集上清，按照SOD、GSH和MDA檢測試劑盒說明書檢測心肌組織勻漿液的上清中SOD、GSH和MDA水平。

1.2.7 ELISA檢測炎癥因子 收集小鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。首先樣品加入反應孔，37℃孵育45 min，再用洗滌液洗滌4次，然后加入生物素標記的抗體，37℃孵育30 min，洗滌后加鏈霉親和素-HRP，混勻，37℃孵育30 min。最后加入顯色劑避光顯色15 min，再加終止液終止反應，450 nm處檢測吸光值。

1.3 統計學分析 用SPSS16.0軟件對實驗數據進行統計學分析，各組間進行單因素方差分析后再進行Duncan′s multiple range檢驗。P<0.01表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌梗死及心肌損傷標志物的影響 圖1A顯示，I/R組小鼠心肌梗死面積大于Ctrl組(P<0.01)。與I/R組相比，I/R+Shi(12.5、25、50 mg/kg)組小鼠心肌梗死面積下降(P<0.01)。通過HE染色觀察心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌組織病變，發現Ctrl組小鼠心肌組織細胞排列規則有序，肌纖維連續無斷裂，未見炎癥細胞浸潤；I/R組小鼠出現心肌組織結構紊亂，橫紋不清，出現斷裂，大量炎癥細胞浸潤等病變；上述心肌組織病變在I/R+Shi(12.5、25、50 mg/kg)組小鼠中得到逐步緩解(圖1B)。另一方面，圖1C顯示，I/R組小鼠AST、cTnⅠ、CK-MB和LDH水平高于Ctrl組(P<0.01)。與I/R組相比，I/R+Shi(12.5、25、50 mg/kg)組小鼠AST、cTnⅠ、CK-MB和LDH水平下降(P<0.01)。以上結果表明，紫草素可改善心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌組織病變，降低心肌損傷標志物水平。

圖1 紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌梗死及心肌損傷標志物的影響Fig.1 Effect of shikonin on myocardial infarction and myocardial injury markers in myocardial ischemia reperfusion injury miceNote: A.The size of myocardial infarct；B.The pathological changes of myocardial tissues were observed by HE staining(×200)；C.The levels of myocardial injury markers.**.P<0.01 vs Ctrl group,##.P<0.01 vs I/R group.

2.2 紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠細胞凋亡的影響 為分析紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠細胞凋亡的影響，利用TUNEL檢測細胞凋亡，蛋白印跡檢測細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9表達。由圖2A可知，I/R組小鼠心肌組織細胞凋亡高于Ctrl組(P<0.01)。I/R+Shi(12.5、25、50 mg/kg)組小鼠心肌組織細胞凋亡低于I/R組(P<0.01)。圖2B顯示，與Ctrl組相比，I/R組小鼠心肌組織Bax、caspase-3和caspase-9表達增強，Bcl-2表達減弱(P<0.01)。與I/R組相比，I/R+Shi(25、50 mg/kg)組小鼠心肌組織Bax、caspase-3和caspase-9表達下降，Bcl-2表達升高(P<0.01)。由此可見，紫草素可減弱心肌缺血再灌注損傷小鼠細胞凋亡，降低Bax、caspase-3和caspase-9表達，增強Bcl-2表達。

2.3 紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠氧化應激的影響 通過檢測SOD、GSH和MDA水平，分析紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠氧化應激的影響。如圖3所示，I/R組小鼠SOD和 GSH水平低于Ctrl組，MDA水平高于Ctrl組(P<0.01)。與I/R組相比，I/R+Shi(12.5、25、50 mg/kg)組小鼠SOD和 GSH水平升高，MDA水平下降(P<0.01)。以上結果說明，紫草素可減輕心肌缺血再灌注損傷小鼠氧化應激。

圖2 紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of shikonin on apoptosis in myocardial ischemia reperfusion injury miceNote: A.The apoptosis of myocardial tissues were detected by TUNEL staining；B.The expression of Bax,Bcl-2,caspase-3 and caspase-9 were measured by Western blot.**.P<0.01 vs Ctrl group；##.P<0.01 vs I/R group.

圖3 紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠氧化應激的影響Fig.3 Effect of shikonin on oxidative stress in myocardial ischemia reperfusion injury miceNote: **.P<0.01 vs Ctrl group；##.P<0.01 vs I/R group.

圖4 紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠炎癥反應的影響Fig.4 Effect of shikonin on inflammatory response in myocardial ischemia reperfusion injury miceNote: **.P<0.01 vs Ctrl group；##.P<0.01 vs I/R group.

圖5 紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠PI3K/AKT信號通路的影響Fig.5 Effect of shikonin on PI3K/AKT pathway in myoc-ardial ischemia reperfusion injury miceNote: **.P<0.01 vs Ctrl group；##.P<0.01 vs I/R group.

圖6 PI3K/AKT信號通路抑制劑可逆轉紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠的影響Fig.6 Effects of shikonin on myocardial ischemia reperfu-sion injury mice reversed by PI3K/AKT pathw-ay inhibitorNote: A.The expression of PI3K/AKT related proteins was detected by Western blot；B.The levels of myocardial injury markers；C.The expression of apoptosis related proteins was tested by Western blot；D.The levels of oxidative stress；E.The levels of inflammatory factors were detected by ELISA.**.P<0.01 vs I/R group；##.P<0.01 vs I/R+Shi(50 mg/kg)group.

2.4 紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠炎癥反應的影響 為分析紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠炎癥反應的影響，利用ELISA檢測炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平。由圖4可知，I/R組小鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平高于Ctrl組(P<0.01)。與I/R組相比，I/R+Shi(12.5、25、50 mg/kg)組小鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.01)。上述結果表明，紫草素可抑制心肌缺血再灌注損傷小鼠炎癥反應。

2.5 紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠PI3K/AKT信號通路的影響 通過檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達，分析紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠PI3K/AKT信號通路的影響。圖5顯示，I/R組小鼠PI3K表達及p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR低于Ctrl組(P<0.01)。與I/R組相比，I/R+Shi(25、50 mg/kg)組小鼠PI3K表達及p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR上升(P<0.01)。由此可見，紫草素可激活心肌缺血再灌注損傷小鼠PI3K/AKT信號通路。

2.6 PI3K/AKT信號通路抑制劑可逆轉紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠的影響 為進一步驗證紫草素是通過PI3K/AKT信號通路發揮保護心肌缺血再灌注損傷小鼠的功效，用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002和紫草素單獨或同時處理心肌缺血再灌注損傷小鼠。如圖6所示，LY294002可逆轉紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達、心肌損傷標記物、細胞凋亡相關蛋白、氧化應激指標及炎癥因子的影響。上述結果表明，紫草素可通過激活PI3K/AKT信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷小鼠病變、細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應。

3 討論

大量文獻報道細胞凋亡、氧化應激及炎癥反應在心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用[10]。越來越多的研究表明許多植物提取物具有調控細胞凋亡、氧化應激及炎癥反應的功效，在各類疾病的治療中發揮著積極作用。

許多疾病中都會出現組織損傷病變及細胞凋亡增加的現象，大量數據顯示植物提取物具有改善各種組織病變及細胞凋亡的作用。據報道紅景天苷可改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞排列紊亂無序、壞死、炎癥細胞浸潤等病變，降低CK-MB和LDH水平；減弱細胞凋亡，上調Bcl-2/Bax比值，抑制caspase-3和caspase-9 活性[11]。Liu等[12]發現紫草素可減輕伴刀豆球蛋白A誘導的急性肝損傷小鼠肝臟組織水腫及壞死等病變，降低AST和ALT水平，降低Bax表達，提高Bcl-2表達。有研究表明在LPS誘導的急性肺損傷小鼠中，紫草素可減輕肺泡出血、炎癥細胞浸潤、間質水腫及肺泡壁增厚等病變[13]。另外，紫草素可改善脊髓受傷大鼠脊髓組織結構疏松、中性粒細胞浸潤的癥狀；降低脊髓細胞凋亡，減弱caspase-3表達[14]。本研究結果表明，在心肌缺血再灌注損傷小鼠中，紫草素可改善心肌組織結構紊亂、橫紋不清、出現斷裂、大量炎癥細胞浸潤等病變，降低心肌損傷標志物AST、cTnⅠ、CK-MB和LDH水平；并減弱細胞凋亡，降低Bax、caspase-3和caspase-9表達，增強Bcl-2表達。

氧化應激在許多病變中都十分重要，越來越多的文獻報道植物提取物在抗氧化應激方面起著積極作用。丹酚酸B可提高心肌缺血-再灌注損傷大鼠SOD水平，降低MDA水平[15]。據報道紫草素可提高腦缺血再灌注損傷小鼠過氧化氫酶(Catalase，CAT)和SOD水平[16]。Lin等[17]研究發現在D-半乳糖胺聯合LPS誘導的急性肝損傷中，紫草素可降低MDA水平，提高GSH水平。此外，在碳離子束輻射誘導的腦損傷小鼠中，紫草素可提高SOD和CAT水平，降低MDA水平[18]。本文結果顯示，在心肌缺血再灌注損傷小鼠中，紫草素可提高SOD和GSH水平，降低MDA水平，減輕氧化應激。

各種疾病中都會出現炎癥反應增強的現象，大量研究表明許多植物提取物具有抗炎的功效。Tang等[19]發現在心肌缺血再灌注損傷大鼠中，原兒茶酸可降低TNF-α水平，抑制炎癥反應。據報道在LPS誘導的急性肺損傷小鼠中，紫草素可降低IL-6、TNF-α和IL-1β水平[20]。有研究顯示，紫草素還可降低骨關節炎大鼠IL-1β和TNF-α水平[21]。另外，在肺炎鏈球菌誘導的肺炎小鼠中，紫草素可降低IFN-γ 和IL-6水平[22]。本研究結果顯示，在心肌缺血再灌注損傷小鼠中，紫草素可降低IL-6、IL-1β和TNF-α水平，抑制炎癥反應。

PI3K/AKT信號通路在各種生物學進程中具有重要的調控作用，越來越多的研究表明許多植物提取物可影響PI3K/AKT信號通路。Jian等[23]研究發現龍須藤黃酮可提高心肌缺血再灌注大鼠PI3K表達及AKT磷酸化水平。據報道在心肌缺血再灌注大鼠中，丹參酮(Tanshinone，IIA)也可提高PI3K表達及AKT、mTOR磷酸化水平[24]。有數據顯示在缺血再灌注肝損傷小鼠中，紫草素處理可提高PI3K表達及AKT磷酸化水平[25]。本文結果顯示，在心肌缺血再灌注損傷小鼠中，紫草素可提高PI3K表達及p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值，且PI3K/AKT信號通路抑制劑可逆轉紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠的影響。

本研究表明，在心肌缺血再灌注損傷小鼠中，紫草素可改善心肌組織病變，降低心肌損傷標記物AST、cTnⅠ、CK-MB和LDH水平；減弱細胞凋亡，抑制Bax、caspase-3和caspase-9表達，增強Bcl-2表達；提高SOD和GSH水平，降低MDA水平；降低IL-6、IL-1β和TNF-α水平；提高PI3K表達及p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值，且PI3K/AKT信號通路抑制劑可逆轉紫草素對心肌缺血再灌注損傷小鼠的影響。綜上所述，紫草素可通過激活PI3K/AKT信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷小鼠組織病變、細胞凋亡、氧化應激及炎癥反應。