化瘀壯骨湯對脛骨骨折模型大鼠骨痂中TGF1、bFGF及BMP-7表達的影響

張彥偉，李 兵

(濮陽惠民醫院 骨外科，河南 濮陽 457000)

骨愈合的過程受生物化學、血液循環狀態、人體微量因子及生物物理因子調控的影響、屬于一種有序、復雜的生物學修復過程[1]。研究表明[2]，10%的骨折由于各種因素的影響致使骨折無法愈合或愈合延緩，所以如何縮短骨折愈合時間，促進骨折愈合非常重要。探討骨折愈合的機制能夠為臨床治療提供可靠的理論依據，化瘀壯骨湯為本院醫師多年總結出的驗方，有消腫止痛、活血化瘀的功效，是骨折治療的常用中藥制劑。本研究構建SD大鼠脛骨骨折模型，以探討化瘀壯骨湯對其骨痂中相關生長因子(TGF-β1、bFGF及BMP-7)表達的影響。

1 材料及方法

1.1 材料

雄性清潔級大鼠48只(購自上海SLAC實驗動物公司)，合格證：SCXK(滬)2013-0005。平均體質量(275±25)g。適應性喂養1周，普通飲食和喂水。

1.2 化瘀壯骨湯制備

化瘀壯骨湯成分：丹參100 g，骨碎補、續斷各150 g，炒胡瓜子、自然銅各100 g，土元90 g，水煎至100 mL濃縮液(劑量根據體質量60 kg成人的10倍劑量[2])，并4℃下保存。

1.3 模型構建

麻醉用戊巴比妥鈉(30 g/L)，根據40 mg/kg劑量腹腔注射。大鼠小腿內側脫毛消毒，仰臥位固定，于脛骨骨干中部上1/3處皮膚做1.5 cm切口，暴露出脛骨骨干，用骨鋸鋸成橫行骨折，再用克氏針(規格：2 mm)向上(逆行)打入脛骨的上端，并穿出皮膚，將克氏針尾鉗斷，順行打進脛骨干。最后活力碘沖洗，并在骨折的周圍滴入抗生素(慶大霉素)4滴，皮膚縫合后歸籠。正常飼養，并連續3天肌注青霉素6～8萬U，以預防感染。經X線檢查顯示大鼠左股骨骨折，髓內針固定在位，對位良好，表明造模成功[3]。48只大鼠均造模成功。

1.4 分組與干預

造模成功后將大鼠隨機分為兩組。化瘀壯骨組自造模當日麻醉蘇醒后給予化瘀壯骨湯100 mL分早晚2次灌胃，模型組給予等量的生理鹽水灌胃。化瘀壯骨組及模型組均分別連續灌胃3天、1周、2周、4周。每個時間點均隨機處死大鼠6只。

1.5 蘇木精-伊紅染色

用尖刀將骨折端組織(1.0～1.5 cm)取下，并置于多聚甲醛40 g/L溶液中，4 ℃下固定48 h。脫鈣后梯度乙醇脫水，并進行流水藍化、在脫水、分色及透明樹脂封固。最后置于顯微鏡下觀察。

1.6 TGF-β1、bFGF及BMP-7表達檢測

檢測用免疫組織化學法(SP)。檢測方法嚴格按照說明書中步驟進行(二甲苯脫蠟、不同濃度乙醇水合、PBS漂洗、枸櫞酸鈉緩沖液加熱盒抗原修復、加一抗、加二抗、顯色復染、脫水封片，用Image-Pro Plus6.0軟件分別對TGF-β1、bFGF及BMP-7的平均光密度值進行分析)。

1.7 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用(x±s)表示，采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠骨折愈合及組織學變化情況

分析由蘇木精-伊紅染色可知，骨折1周時，有骨痂出現，主要有成熟及未成熟軟骨細胞，骨折處皮質附近軟骨細胞表現肥大，局部有少量的新生骨小梁，周期有成骨細胞。化瘀接骨湯組的骨膜反應比模型組明顯，骨痂2周時達最大，內部有成骨細胞代替軟骨細胞，鏡下活血接骨組能見到少量新生編織骨。模型組主要表現為較成熟的軟骨細胞。在骨折4周時化瘀接骨組的新生編織骨有明顯增加，骨小梁明顯變粗，骨髓腔形成，能見到成熟的骨組織，骨痂(內外)開始變薄。而模型組的骨小梁數目較化瘀接骨組少，且其間有少量軟骨細胞。見圖1。

注：A1、A2、A3分別為模型組1周、2周、4周時組織學變化；B1、B2、B3分別為化瘀壯骨組1周、2周、4周時組織學變化(HE×100)。

2.2 兩組大鼠各時間點TGF-β1、bFGF及BMP-7表達

化瘀壯骨組骨折1周、2周、3周及4周時TGF-β1、bFGF及BMP-7表達與模型組比較，均有不同程度的升高(P<0.05)。骨折2周時化瘀壯骨組bFGF表達明顯高于模型組(t=3.929，P=0.003)；骨折3周時化瘀壯骨組TGF-β1、BMP-7表達明顯高于模型組(t=2.605、3.152，P=0.01、0.002)。見表1、圖2。

時間TGF-β1模型組化瘀壯骨組bFGF模型組化瘀壯骨組BMP-7模型組化瘀壯骨組骨折1周0.173±0.0260.191±0.0200.189±0.0170.212±0.0330.193±0.0430.196±0.050骨折2周0.161±0.0430.169±0.0170.207±0.0330.283±0.034a0.204±0.0290.246±0.059骨折3周0.139±0.0370.189±0.029a0.183±0.0270.185±0.0340.136±0.0210.193±0.039a骨折4周0.124±0.0280.141±0.0180.121±0.0200.131±0.0110.130±0.0150.150±0.016

注：與模型組比較，aP<0.05。

注：模型組A、化瘀壯骨組A為骨折3周時TGF-β1表達；模型組B、化瘀壯骨組B為骨折2周時bFGF表達；模型組C、化瘀壯骨組C為骨折3周時BMP-7表達。

圖2 兩組大鼠TGF-β1、bFGF及BMP-7表達情況(SP×200)

3 討論

祖國醫學中顯示，骨折主要的病機為瘀血阻滯，因此古代醫家多從“血”論治，有了“瘀未去則骨不接”“折傷專主血論”及“瘀去則新骨生”的說法[4]。現代藥理學研究則表明[5]，骨折后的局部組織甚至全身血液往往在高凝狀態，骨組織的損傷使機體產生應激反應，出現微循環障礙，使血液動力受到影響，這些病理特征均與血瘀相關。因此，改善骨折機體的“血瘀”狀態，就能使骨組織灌注得到改善。化瘀壯骨湯為本院長期實踐得出的治療骨折的驗方，方中丹參為君藥，能去舊生新，活血化瘀，續斷、骨碎補則能補肝益腎，土元接筋續骨，破血散瘀，共為臣藥，炒甜瓜子止痛化瘀，自然銅接骨續筋，同為佐藥，諸藥合用，達到接骨續筋的目的。現代藥理研究證實[6]，丹參還具有補益肝腎之功，使筋脈有滋養，骨化生有源，促進骨折后受損組織瘀血吸收，為骨折新生創造良好環境。骨碎補能夠使蛋白多糖(促進鈣化因子)合成增加，從而加速骨的生長。自然銅主要成分之一為二氧化硫，其能夠增強骨的抗撕力，加速骨痂的形成[7]。有研究顯示[8]，土元提取物使血管新生加快，能夠促進肉芽組織生長。本研究對骨折組織形態變化觀察發現，化瘀壯骨組大鼠新生骨數量與骨膜反應改善比模型組明顯，由此證實化瘀壯骨湯具有接骨通絡之功。

TGF-β1為轉化生長因子家族成員，廣泛在人體組織中存在，特別在骨組織中生物活性廣泛，可促進細胞的增殖、分化，參與組織的修復，誘發軟骨的形成等。有研究顯示，TGF-β1能夠誘導纖維連接蛋白及細胞外基質的形成。bFGF屬于一種骨代謝調節因子，在骨吸收及骨形成中起重要作用。BMP-7屬于骨形態發生蛋白(BMPs)家族中一員，是一類分子量較低的肽類物質，在骨基質中廣泛存在。BMP-7能夠促使骨間充質干細胞轉化為軟骨細胞及成骨細胞，從而促進骨組織修復。本研究結果顯示，與模型組比較，化瘀壯骨組大鼠接受化瘀壯骨湯治療后，骨痂組織中TGF-β1、bFGF及BMP-7表達在各個時間點均有不同程度的升高，尤其在骨折愈合的2周或3周，兩組間表達有顯著性差異，由此提示，化瘀壯骨湯能夠使骨痂組織中TGF-β1、bFGF及BMP-7表達升高，從而達到促進骨折愈合的目的。此結果與王希強等[10]的研究一致。

綜上所述，化瘀壯骨湯能夠促進大鼠骨折愈合，其作用機制可能與促進骨痂組織中TGF-β1、bFGF及BMP-7表達有關。本研究也有不足之處，未能對大鼠血清中相關生長因子水平進行分析，這也是下一步研究的方向。