微生物轉化技術在中藥資源開發中的應用研究

馬逢時，劉家水，談永進

(安慶醫藥高等專科學校 藥學系，安徽 安慶 246052)

中藥資源是我國的民族瑰寶，也是中華民族的國家戰略資源[1-2]。中藥資源的研究已有千年歷史，藥學研究者們致力于從中藥資源中尋找高效、安全的藥物成分。隨著中藥現代化進程的加快，中藥資源的利用率得到一定的提高，各種現代科學技術也逐漸引入中藥資源的開發利用之中，進一步促進了中藥的發展[3-6]。

將微生物轉化技術與中藥資源相結合，可以解決中藥資源水溶性差、毒性強、活性低、資源匱乏等問題，微生物轉化技術是推動中藥資源開發、中藥現代化的重要途徑[7-8]。微生物轉化反應條件溫和、特異性較強、轉化產率較高，且綠色無污染。應用此技術(主要是轉化體系中產生的酶系)對已存在天然中藥資源進行轉化，相比傳統化學方法更高效，同時能夠在一定程度上模擬藥物代謝，從而獲得更多新的活性化合物[9-11]。微生物轉化技術包括環氧化、脫水、加脫氫、酯化以及糖基化等反應，與傳統中藥活性成分研究方法相比，在轉化速度和轉化質量等方面均表現出了顯著優勢，在中藥資源開發應用中具有廣闊的前景。在新藥開發以及藥物代謝研究等方面均需要以對微生物轉化技術的應用為支持。

1 微生物轉化應用于中藥的優勢

微生物轉化技術的本質是利用微生物所產生的酶以外源性的中藥化合物作為底物進行結構轉化的過程。相比傳統化學轉化而言，微生物所催化的反應是很多化學合成難以進行的反應。隨著當代生物技術的發展，中藥的微生物轉化研究中引入溶劑工程、誘變和基因重組等新技術，這為新的活性中藥衍生物提供更多的可能性。微生物轉化特點，見表1。

表1 微生物轉化中藥的優勢

2 微生物轉化對天然藥物資源應用

2.1 皂苷類資源微生物轉化

皂苷類化合物具有中樞神經系統作用、抗腫瘤作用、抗炎、抗過敏、抗菌、抗病毒、降膽固醇及心血管活性等藥理活性[12-13]。研究表明微生物轉化法可有效改變皂苷糖鏈結構，提高皂苷的生理活性[14-15]。對于皂苷類的微生物轉化，研究最多的是人參皂苷[16]，Quan等[17]利用從韓國傳統發酵食品泡菜中分離出的類消化乳桿菌LH4 (LactobacillusparalimentariusLH4)將人參皂苷Rb1轉化為藥理學活性更強的CK。以TLC，HPLC和NMR分析酶反應，類消化乳桿菌LH4無細胞酶在30 ℃、pH 6.0反應72 h的最佳條件下，1.0 mg/mL的人參皂苷Rb1轉化得到0.52 mg/mL的CK，具有88%的摩爾轉化率。無細胞酶水解人參皂苷Rb1的C-3和C-20的兩個葡萄糖基。人參皂苷Rb1的水解途徑為：人參皂苷Rb1→股藍總苷XVII和人參皂苷Rd→人參皂苷F2→CK，類消化乳桿菌LH4具有應用于工業制備CK的潛力。利用微生物刺囊毛霉菌對20(R)-人參二醇進行轉化共分離鑒定出了5個化合物，對抑制HSC-T6細胞增值的作用也增強[18]。Lee[19]通過比較新鮮紅參以及發酵紅參(微生物菌株與不加入微生物菌株)中20種人參皂苷含量的變化，研究發現，相比新鮮紅參，紅參發酵后，人參皂苷Re、Rg1和Rb1含量下降，但是人參皂苷Rh1、F2、Rg3和CY的含量增高，而且加入微生物菌株進行發酵后酚類物質和還原糖的含量最高。菌株S329屬于溜曲霉(Aspergillustamarii)，人參皂苷Re轉化人參皂苷Rh1的轉化率為27.65%[20]。目前人參大多采用口服給藥，以傳統方法明確其體內腸道代謝過程具有一定的困難性，采用微生物轉化技術模擬體內代謝過程對明晰藥物療效和作用機理有很大意義。

此外，應用微生物技術轉化絞股藍皂苷[21]、積雪草皂苷[22]、薯蕷皂苷元[23]、和芍藥苷[24]、連翹苷[25]、虎杖苷等[26]，以提高其皂苷含量、發現新化合物和提高作用效果的研究也多有報道。

2.2 黃酮類資源微生物轉化

黃酮類成分在體內外具有不同的生物活性，但是由于天然黃酮資源限制以及混合物分離的難度，黃酮類成分的研究受到限制，應用微生物技術轉化天然黃酮產物是目前黃酮類成分研究的新方向[27-28]。Jones等[29]通過大腸桿菌復合羥化酶HpaBC將柚皮素高效轉化為圣草酚，此外HpaBC能夠高效轉化各種鄰羥基黃酮類化合物和黃酮類衍生物。腸道菌群可能存在能夠將大豆苷元轉化為雌馬酚的細菌，雌馬酚比大豆苷元生物學活性更強[30]。利用外源菌株改變大鼠雌馬酚產生能力，擬桿菌門細菌在轉化過程中起著十分重要的作用[31]。Parajuli等[32]在大腸桿菌BL21(DE3)發現區域專一糖基轉移酶，其能轉化非瑟酮得到非瑟酮-3-O-葡萄糖苷和非瑟酮-3-O-鼠李糖苷，轉化率高達99%，另外大腸桿菌BL21(DE3)轉化槲皮素、山萘酚、楊梅素等黃酮醇到各自糖苷的轉化率達到95%以上。Wang等[33]從南京土壤中分離得到CGMCC 4913，其在10%乙醇條件下將葛根素轉化為7-O-果糖苷的葛根衍生物，轉化率達97.6%，其衍生物的水溶性和抗氧化活性得到較大改進[34]。

多甲氧基黃酮 (PMF)是主要活性黃酮，它表現出抗癌、抗氧化損傷等多種生物活性。Kim等[35]首次以活性為向導篩選PMF代謝相關的人體腸道細菌來研究PMF的生物轉化和體外表征，最終篩選出Blautia屬MRG-PMF1菌種，MRG-PMF1將PMF代謝至對應的去甲基化黃酮，其中5，7-二甲氧基黃酮和5，7，4’-三甲氧基黃酮分別代謝為5，7-二羥基黃酮 (白楊素)和5，7，4’-三羥基黃酮 (芹菜素)，C-7位甲氧基優先水解。此外，MRG-PMF1還具有去糖基化活性，轉化生成相應的糖苷配基，該菌株的發現對于我們了解黃酮類化合物在人體腸道代謝過程以及發現新的生物活性黃酮化合物具有很大意義。微生物發酵處理方法可以改善酚酸、黃酮含量以及清除自由基的能力。比較芽孢桿菌菌種發酵、烤、蒸等工藝后菝葜葉的總酚酸和總黃酮的含量，結果表明微生物發酵過后菝葜葉的總酚酸和總黃酮含量顯著提高，尤其是釀酒酵母和米曲霉發酵過后氧自由基吸收能力最高[36]。雌性啤酒花球果廣泛應用于釀造工業中，目前研究發現其對于制藥工業也有較大的應用價值，啤酒花含有大量黃酮類成分，其具有抗癌、抗氧化、抗微生物、抗炎和雌激素作用。尤其啤酒花球果黃酮類化合物的生物轉化以及在胃腸微生物群相關的微生物酶促反應實現了該黃酮類成分的催化和轉換，所得轉化產物在制藥工業中具有很大的應用潛力[37]。

鑒于異黃酮及其相關糖復合物在人類健康的重要作用，對于其酶促轉化引起藥學工作者相當大的興趣。You等[38]將乳雙歧桿菌AD011中的β-葡萄糖苷酶基因轉載至兩歧雙歧桿菌BGN4中，構建β-葡糖苷酶的活性和熱穩定性高表達的重組兩歧雙歧桿菌B919G菌株，B919G粗酶提取液能在4 h內轉化黃豆苷和染料木苷，其菌體本身轉化豆奶中黃豆苷和染料木苷也可在6 h內完成，相比D011轉化效率更高。B919G菌株的構建能將豆奶發酵產生更高價值的異黃酮類成分，同時也保留了本身益生菌的功效。Du等[39]也從新鞘氨醇桿菌GX9中分離得到一種新穎的β-葡糖苷酶，對黃豆苷和染料木苷的水解活性很高。革蘭氏陰性厭氧微生物MRG-1顯示去糖基化和還原黃豆苷的高活性，能定向轉化異黃酮、大豆苷元、染料木素、羥基異黃酮和芒柄花素，產生相應的黃酮衍生物[34]。由于對食品安全和環境問題，黃酮類化合物生物合成的安全、廉價和基質可再生性問題正日益引起人們的注意。Wu等[41]對L-酪氨酸合成(2S)-柚皮素的合成途徑進行優化以及從D-葡萄糖合成(2S)-柚皮素的異源途徑的構建，提高了在大腸桿菌中合成(2S)-柚皮素的合成效率，實現了直接從D-葡萄糖合成(2S)-柚皮素的合成，為經濟發展過程中微生物生產黃酮類化合物提供了新的方法。

2.3 生物堿類資源微生物轉化

生物堿是植物體內一類含氮有機化合物，生物堿大多有較復雜的環狀結構，多呈堿性，大多具有顯著的生理活性，如鎮痛、解痙、抗菌消炎、止咳平喘、抗癌等作用。利用微生物轉化對生物堿結構改造或者合成其他藥物活性成分，有利于發現新的藥用價值的生物堿衍生物。微生物轉化涉及羥基化反應、氧化反應、水解反應、去甲基反應等。

原小檗堿是中藥植物中豐富的生物活性分子，通過應用代謝工程與合成生物學策略可以將簡單的芐基異喹啉轉換至復雜的生物堿原小檗堿，通過優化釀酒酵母等載體中生物合成途徑，實現原小檗堿類生物堿的高效合成[42]，這也為利用酶法合成或微生物細胞工廠從頭合成其他高價值的化合物奠定基礎。煙堿是在煙草中的主要生物堿，也是在煙草廢棄物中主要的有毒化合物。生物修復采用高效有力的微生物特定的酶和生化途徑降解煙草生物堿等劇毒雜環化合物，是清理環境污染最有前途的方法。煙堿代謝轉化后，這些嗜酸性微生物使用煙堿作為唯一碳、氮和其生長的能量來源[43]。煙堿可以由細菌通過經吡啶途徑或吡咯烷途徑降解。6-羥基-3-琥珀吡啶(HSP)羥化酶是兩通路中共同的中間關鍵酶，其將煙堿轉化為2，5-二羥基吡啶[44]。Tang等[45]對惡臭假單胞菌降解煙堿的過程進行解析，識別參與降解過程的煙堿代謝酶，3-琥珀吡啶轉化為6-羥基-3-琥珀吡啶是molybdopeterin結合氧化酶、molybdopterin脫氫酶和鐵氧還蛋白共同參與的結果，此外還發現了煙堿氧化還原酶 (nicA2)，并進行基因的克隆表達。這對自然界中有毒化合物的降解有很大推動作用。由心果堿生物合成罌粟嗎啡需要P450氧化還原酶的參與[46]。

2.4 其他類型化合物微生物轉化

海蔥提取物應用于心臟疾病的治療已有幾百年的歷史。德國順勢藥典中就有通過發酵步驟制備海蔥提取物的制備過程，Knittel等研究發現，海蔥存放一年后，由于微生物和植物酶活性下降，總的蟾蜍二烯羥酸內酯含量減少了50%，蟾蜍二烯羥酸內酯苷代謝和降解的速率也因糖苷配基結構的差異而不同。在發酵過程中，黃酮類成分也發生脫水代謝反應，這為醫療發酵海蔥提取強心苷類和酚類化合物以及兩者的穩定性提供了有價值的信息[47]。納豆枯草芽孢桿菌能增加決明子活性成分蒽醌苷元的含量，從而增強決明子臨床療效[48]。Hadibarata等[49]以白腐真菌蜜環菌屬F022轉化蒽醌得到二氨基蒽醌、苯甲酸、2-羥基-3-萘甲酸和香豆素4種化合物，因此F022可應用于多環芳烴的生物修復。Paludo等[50]以小克銀漢霉轉化β-拉帕醌獲得2種β-拉帕醌的糖基化衍生物，其抗乳腺癌活性雖然降低，但是細胞毒性也明顯降低。

3 結語

近年來中藥資源得到較大利用，其在分離純化、藥理研究以及加工技術等方面都取得了一定的進展，但是天然產物結構復雜，在自然界中含量也有限，有些化合物利用化學合成并不能完成，或者其成本較大，污染也比較嚴重。利用微生物轉化可以有效制備化學合成難易完成的新型化合物。微生物轉化成為目前藥學研究者關注的熱點，但是要實現工業化生產還有一定難度，微生物群基因庫的探索、相關關鍵酶的合理設計、發酵和生物轉化介質進行深入研究探索，能提高生物轉化的效率。有的化合物代謝之后才能發揮藥效，利用微生物對化合物進行代謝轉化研究，可以避免體內代謝的損失。尋找耐酸堿、耐高壓和熱穩定性好的極端微生物，結合高通量篩選技術平臺篩選高效新型生物催化劑，對微生物轉化底物選擇性及立體選擇性規律、生物轉化機制進行深入研究，以能定向獲得目的產物或者發現高效的創新藥物。中藥微生物轉化研究對中藥資源的開發利用意義重大，通過對已有中藥資源微生物轉化處理，可以衍生大量的化合物，為新藥物的篩選奠定基礎，對藥物的研發和生產具有重要的理論價值和應用前景。