美洲大蠊質量評價研究進展

鄧雨嬌，曾陳娟，馬倩，許潤春，馬鴻雁*，耿福能

(1.成都中醫藥大學/中藥材標準化教育部重點實驗室/中藥資源系統研究與開發利用重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137;2.四川好醫生攀西藥業有限責任公司/藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，四川 西昌 615000)

美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.是蜚蠊科Blattidae大蠊屬Periplaneta昆蟲，與其他蜚蠊目昆蟲均被稱作蟑螂，因其生命力頑強為人們所熟知。在大多數人眼中，其能傳播疾病、污染食物、造成過敏反應等，是令人聞之色變的衛生害蟲，鮮有人了解其作為傳統中藥材的歷史。美洲大蠊早在《神農本草經》就有入藥的記載，后于《新修本草》、《本草綱目》等著作中均有記錄，現代藥學典籍如《中藥大辭典》《云南省中藥材標準》等亦有收錄。美洲大蠊具有活血化瘀、清熱解毒、消積、生肌的功能，現代研究表明其具有保肝、抗腫瘤、抗炎、增強機體免疫能力、促進組織修復等功能[1]，以其為原料開發的康復新液、心脈隆注射液、肝龍膠囊等在臨床上應用廣泛，效果顯著。

全世界蜚蠊目昆蟲眾多，已知種類有4 600種，460個屬，如美洲大蠊、黑胸大蠊、日本大蠊等，我國記載有6科260余種[2]。不少蜚蠊形態特征與美洲大蠊極為相似，容易造成混淆，從而出現摻假的現象，嚴重影響產品的質量，進而影響療效，甚至產生不良反應，危及患者生命安全。同時，不同產地、不同飼養條件、不同采收炮制方法下的美洲大蠊有效成分含量也有差異，質量均一穩定難以得到保障。藥材質量優劣會直接影響產品的臨床療效，而目前美洲大蠊鑒定、質量控制尚無統一標準，現有的質量評價方式專屬性不強。現代技術的發展使得分析方法日新月異，以期為美洲大蠊質量評價帶來新生機，結合傳統與現代評價方法在完善美洲大蠊藥材的質量評價體系中將發揮關鍵作用。

本文對美洲大蠊藥材鑒別及質量評價方法、質量標準現狀進行概述，分析質量評價體系中存在的問題并提出相應對策,最終構建出相對完善的美洲大蠊質量評價體系，為美洲大蠊藥材質量評價提供參考和新思路。

1 美洲大蠊藥材鑒別及質量評價方法

1.1 性狀鑒別法

傳統性狀鑒別法是根據美洲大蠊藥材本身表面特征來鑒別其真偽、優劣的方法，是最基本的方法，從古至今都有著廣泛的應用。最早記錄美洲大蠊入藥的《神農本草經》中未見對其性狀的描述，南北朝時期陶弘景在《名醫別錄》與《本草經集注》中分別對蜚蠊做了以下描述：“形似蠶蛾，腹下赤，即南人謂之滑蟲也”[3]“蜚蠊，形似蟄蟲而輕小能飛”[4]；唐代《本草綱目拾遺》中謂之：“狀如蝗，蜀人食之”[5]；明代李時珍在《本草綱目》中有更為詳盡的記載：“今人家壁間灶下極多甚者聚至千百，身似蠶蛾，腹背俱赤，兩翅能飛，喜燈火光，其氣甚臭，其屎尤甚。”[6]歷代本草記載美洲大蠊形態大小有差異，但基本都是從其形狀、顏色等來進行判別，為現代性狀鑒別奠定了基礎?，F代性狀鑒別多以體型、顏色、翅膀形狀、前后胸背板形狀、足、氣味等為主，最主要鑒別要點為背板淡黃色至黃色，中部有黑色至棕褐色蝴蝶斑，其后緣中央向后延伸呈小尾，前緣有淡黃色“T”形小斑[7]。對于形態完整、特征明顯的美洲大蠊藥材，應用該方法可簡便、快速、經濟進行鑒別，但經過干燥及炮制后的藥材翅、尾須等極易脫落,胸部特點也不甚清晰,無疑增大了鑒定難度。同時，性狀鑒別主要依靠專業人員的經驗進行判斷，對鑒定人員要求高且主觀性較強，較難實現客觀化及批量化鑒別，使得該法具有一定的局限性。

1.2 顯微鑒別法

顯微鑒別法是利用顯微鏡對藥材組織、粉末等進行觀察，用以鑒別真偽、優劣的方法。美洲大蠊藥材在炮制、儲存、運輸過程中極易破碎，僅憑外觀形狀難以準確鑒定，可借助該法對美洲大蠊藥材進行分析鑒別。何文楷等[8]對15批不同來源的美洲大蠊藥材粉末進行顯微鑒別，可以明顯觀察到剛毛、足部、體表、翅部碎片，可與其他粉末進行快速區分，該方法為快速鑒別美洲大蠊提供參考。傳統的顯微鑒別法要求鑒定者掌握切片、制片、特征顯微形態等專業知識，同時，對于粉末為超微粉時，該方法也具有一定的局限性。因此，需結合現代新技術如掃描電鏡、顯微攝影與計算機圖處理技術等[9-10]，為美洲大蠊藥材鑒別提供參考。

1.3 色譜法

1.3.1 薄層色譜法(TLC) 薄層色譜法利用不同成分在同一吸附劑親和性的差異使得各成分分離的方法，具有操作簡便、展開速率快等優點。該方法可快速分離脂肪酸、氨基酸、生物堿、核苷酸等物質，在美洲大蠊真偽鑒別及質量控制發揮了重要作用。李海波等[11]采用薄層色譜法對美洲大蠊藥材中4種氨基酸(亮氨酸、丙氨酸、氨基丙酸、甘氨酸)進行定性鑒別，該方法斑點清晰、易于識別，為美洲大蠊藥材鑒別與質量控制提供了有效的方法。張臻等[12]采用TLC法對美洲大蠊提取物進行研究，該提取物與對照藥材均顯示5個相同顏色的斑點，為美洲大蠊提取的質量控制提供參考。

1.3.2 高效液相色譜法(HPLC) 高效液相色譜法具有分析速度快、專屬性強、重現性好等特點，在美洲大蠊有效含量測定及指紋圖譜構建研究中也有著廣泛的應用。肖培云等[13]建立了鄰苯二甲醛柱前衍生化高效液相色譜法測定美洲大蠊藥材中17種氨基酸成分的方法，并測定了不同養殖場飼養的美洲大蠊氨基酸含量，結果表明不同養殖場美洲大蠊藥材各氨基酸含量與總氨基酸含量均有差異，為美洲大蠊藥材質量評價提供參考。黃博等[14]采用HPLC法建立了同時測定尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷的方法，為完善美洲大蠊質量控制奠定基礎。

美洲大蠊成分復雜，且功效眾多，選取某一類有效成分進行質量控制只是一種過渡性手段，而指紋圖譜技術具有“整體性”和“模糊性”屬性，符合中藥中多種成分、多靶點、多種機制共同作用的特點，突破了當前僅憑一種或一類成分為指標的“以點代面”的質量評價模式，為其整體質量控制提供新思路。王利春等[15]通過HPLC建立美洲大蠊藥材及其提取物的指紋圖譜，標定了11個共有指紋峰，可用于美洲大蠊中生物堿測定，也為其整體質量評價提供思路。吳紅梅等[16]以肌苷為對照峰，建立了10批美洲大蠊HPLC指紋圖譜，并通過共有峰的差異及是否含有特征峰，將美洲大蠊與黑胸大蠊區分開，可用于美洲大蠊藥材鑒定及質量控制。指紋圖譜雖包含了豐富的化學信息,但美洲大蠊中的有效成分多為氨基酸、蛋白質、多糖、多肽等，大多沒有紫外吸收，不能完全包含有效成分。此外，只反映了其化學信息，未關聯藥效，難以表征其內在質量。因此，利用指紋圖譜進行質量評價與控制有一定的局限性，但對完善其質量評價體系有著難以替代的作用。

1.3.3 超高效液相色譜法(UPLC) 超高液相色譜法原理與高效液相色譜法基本相同，但相較于HPLC具有分析速度更快、分離度更好、檢測靈敏度更高的優點，可作為美洲大蠊藥材及制劑質量控制的有效方法之一。郭昕等[17]建立了美洲大蠊乙醇提取物中原兒茶酸測定方法，為美洲大蠊相關制劑的質量控制提供借鑒。吳紅梅等[18]建立了15批康復新液的UPLC指紋圖譜，所有樣品均可在23 min內完全出峰，相似度大于0.9，極大地提高了分析速率，為康復新液的質量評價提供了一種高效、快速的方法。

1.3.4 氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS) 氣相色譜-質譜聯用技術將色譜法高效分離的優勢與質譜法準確鑒別的特點結合起來，在一些缺少明確對照品中藥材的鑒定和質量控制中發揮了重要作用。在美洲大蠊藥材質量評價中，GC-MS法常用于其油脂類成分的分析。羅建蓉等[19]利用GC-MS法分析了美洲大蠊藥材中成分，共鑒定出35個成分，以油酸、亞油酸、棕櫚酸、烷烴為主要成分。李江維等[20]對美洲大蠊原粉、去油粉末中油脂成分進行研究，二者油脂含量有較大差異，但主要都含有烷烴、脂肪酸及其酯類化合物。焦春香[21]對美洲大蠊醇提水溶性成分中的揮發性成分進行了研究，共鑒定出29種成分，以多元醇、有機酸、脂肪酸及其酯類為主，同時含有少量的生物堿類物質。

1.4 光譜法

1.4.1 紫外-可見分光光度法(UV) 紫外-可見分光光度法是利用溶液中分子或基團吸收紫外和可見光后產生電子能級躍遷而形成吸收光譜，用以定性和定量測定的方法，因其操作簡單、測定速度快、準確度較高等優點，在中藥含量測定領域得到了廣泛的應用。李海波等[11]建立了UV測定美洲大蠊藥材中總氨基酸含量的方法，為美洲大蠊質量控制提供依據。肖培云等[22]采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量，建立了美洲大蠊藥材中總糖含量測定的方法，為美洲大蠊藥材的質量控制提供依據。肖培云等[23]以甘露醇為標準品，建立了美洲大蠊中甘露醇的含量測定方法，為其質量控制提供了實驗依據。

1.4.2 原子光譜法 原子光譜法包括原子發射光譜(AES)、原子吸收光譜(AAS)、原子熒光光譜(AFS)，具有選擇性強、靈敏度高、分析范圍廣等特點，既可測定中藥中金屬、類金屬元素，又可間接測定某些非金屬元素。張春妹等[24]利用原子熒光光度法測定云南省不同產地美洲大蠊藥材As、Hg、Pb、Cd的含量，13批樣品重金屬含量均符合《四川省中藥材標準》中對重金屬限度要求，但不同產地藥材各元素含量存在一定差異，該方法為美洲大蠊重金屬殘留量測定提供了有效方法，也為美洲大蠊藥材臨床安全使用提供了一定的參考。

1.5 電泳技術

該技術根據美洲大蠊中各成分相對分子量和所帶電荷不同，因而在同一電場下移動速度和距離不同這一原理進行分離和鑒定的方法。美洲大蠊中含有多肽及蛋白質類成分，是其主要藥效成分之一，具有抗腫瘤、免疫調劑、修護肝損傷抗氧化等作用[25-27]。電泳技術在美洲大蠊多肽、蛋白質的分離及分析方面有廣闊的應用前景，可為其藥效物質的分析與質量控制提供一定的參考。吳少輝等[28]初步探究了Tricine-SDS-PAGE法分離美洲大蠊小分子肽的方法，為美洲大蠊小分子肽的分離鑒定提供依據。張丹[29]利用十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析了美洲大蠊凍干粉中小分子多肽的分子量，為美洲大蠊凍干粉質量標準的建立提供參考。

1.6 DNA條形碼技術

DNA鑒定是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術，根據不同物種基因堿基排列順序不同來進行鑒別，是傳統形態鑒別方法的有效補充[30]。麻錦楠等[2]對蜚蠊目10種共574個昆蟲樣本COI基因進行PCR擴增，并比較種間及種內遺傳距離，結果表明種間遺傳距離明顯大于種內，說明DNA條形碼技術可用于美洲大蠊物種的鑒定。有學者利用形態識別和DNA條形碼技術將日本大蠊，德國小蠊，東方蜚蠊，美洲大蠊，側緣蜚蠊和長須蜚蠊區分開[31-32]。DNA條形碼技術為美洲大蠊的鑒別提供了更為準確、可靠、客觀化的方法。

1.7 其他技術

氫核磁共振(1H-NMR)的代謝組學技術是利用1H-NMR對動物內源性代謝物進行分析的技術，具有分析速度快、適應性好、更加完整與系統等優點。耿福能[33]運用基于1H-NMR的代謝組學技術,同時測定了美洲大蠊及其提取物的整體化學成分，并鑒定出3個核苷(尿嘧啶、肌苷、次黃嘌呤)、12個氨基酸類化合物(谷氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸)，建立了1H-NMR指紋圖譜，為美洲大蠊整體質量控制提供參考。

2 美洲大蠊藥材質量標準現狀

美洲大蠊為傳統中藥品種之一，目前暫未被《中國藥典》收錄，僅被4個地方中藥材標準收載，具體收載情況見表1。各省中藥材標準對其性狀鑒別存在差異，檢查項選取和測定方式也不盡相同。其中福建省質量標準僅有性狀鑒別，《湖南省中藥材標準》《云南省中藥材標準》對藥材中丙氨酸進行了定性鑒別，而未進行定量研究，《四川省中藥材標準》相對更加完善，除鑒別與檢查項外，還對其中氨基酸含量進行規定，含總氨基酸以丙氨酸計，不得少于0.45%，另外還對其中重金屬含量進行了限定。在各省中藥材標準中，藥效成分如核苷、肽類、多元醇類等成分未得到有效的定性及定量控制；易對人體造成危害的黃曲霉素含量、農藥殘留量也未進行限定。綜上所述，美洲大蠊藥材質量標準急需得到統一、提高、完善，從而保證藥材質量，以保證其臨床用藥的安全性。

表1 美洲大蠊質量標準現狀[34-37]

注：“+”表示此項檢查已納入中藥材標準，“-”表示此項檢查未納入中藥材標準。

3 美洲大蠊藥材質量評價問題及對策

3.1 品種鑒別手段有待提高

品種鑒定和真偽鑒別是美洲大蠊藥材鑒定與質量控制的首要任務，目前檢查的鑒定方法未結合美洲大蠊自身特性，專屬性較低。作為動物藥，其鑒定方法不能照搬植物藥和化學藥品的方法，通過理化鑒別方法來進行，應考慮其特殊性，在傳統物種分類的基礎上，引入現代新方法新技術構建起專屬性鑒定方法。

隨著分子生物學技術的不斷發展，分子鑒定技術的理論和方法在中藥材鑒定領域得到了廣泛的應用，該技術不僅能對完整的美洲大蠊藥材進行鑒定，還能對其破碎的組織、粉末等進行準確的鑒定，可利用該技術，尋找美洲大蠊DNA片段序列中特異性位點，設計高特異性的鑒別引物，開發出分子鑒定試劑盒用以快速鑒別。此外，美洲大蠊作為動物藥，其中含有大量的蛋白質與多肽類物質，此類物質是基因組在細胞水平的表達，因此，除了與同一或不同物種的共有蛋白質和多肽外，其組織器官中還含某些標志性蛋白和多肽，可利用表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)片技術[38]或基質輔助激光解析附串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF-MS)技術[39]尋找美洲大蠊中所含標志性蛋白和多肽進行鑒別。綜上所述，美洲大蠊藥材的鑒別應在傳統物種分類的基礎上，結合現代技術建立起關鍵鑒別技術，實現精準、靈敏、快捷的藥材品種鑒定和真偽鑒別方法。

3.2 內在質量評價方法有待改進

美洲大蠊成分復雜，大多為蛋白質、氨基酸、多肽等大分子物質，但藥效物質基礎不明確，作用機制不清晰?，F有的美洲大蠊內在品質評價依舊拘泥于找成分、測成分的模式，缺乏對其專屬活性成分的尋找與評價，評價方式也缺乏專屬性，使得美洲大蠊質量評價進展緩慢，難有突破。因此，深入開展美洲大蠊藥效物質基礎研究，尋找其中特異性有效成分，并建立化學成分與藥效間的關聯是進行質量控制的基礎。結合動物藥自身特點，在評價美洲大蠊內在質量時，可引入現代生物評價技術和方法對其進行質量控制。如利用生物活性檢測，建立與其功效或毒性相關聯的生物評價方法；應用高內涵分析、組學生物標志物等技術，建立與其作用機制相關的評價方法。最終構建以生物評價為主，輔以化學成分定性及定量、指紋圖譜的內在質量評價方法。

3.3 安全性評價體系有待完善

美洲大蠊屬于動物藥之一，傳統中醫謂之“血肉有情之品”，在臨床使用中發揮其獨到的療效，但其中油脂、蛋白質、重金屬等存在潛在危害，因此安全性評價也是不容忽視。美洲大蠊安全性評價中，僅對其重金屬含量進行了限定，其他外源性物質，如農藥殘留量、黃曲霉素含量、二氧化硫殘留量等均未得到相應控制。除外源性物質，內源性物質如油脂、蛋白質等具有潛在安全性問題的成分也未加以控制。有研究表明美洲大蠊油脂對于肝損傷小鼠具有毒副作用，可能與其中棕櫚酸有一定關系，若以全粉入藥會加重肝功能不全者的肝損傷。蛋白質的過敏原蛋白為Pera 1-Pera 10，其中Pera 9為主要過敏原之一[40]，會引起IgE介導的I型超敏反應從而損傷機體。但油脂類成分具有抗氧化、抗癌、抑菌等功效[41-43]，油脂中不飽和脂肪酸可防治心血管疾病，亞油酸可降低血脂從而防止動脈粥樣硬化等[44],蛋白質具有抗腫瘤、免疫調劑作用、修護肝損傷抗氧化等作用。油脂與蛋白質既是藥效成分又有潛在安全隱患毒，如何將美洲大蠊油脂成分含量控制在安全有效的范圍內，是美洲大蠊安全性評價的關鍵問題之一。外源性與內源性物質含量需加以控制，共同構建起美洲大蠊安全性評價方法，從而保證臨床用藥的安全可靠，這對完善和提高美洲大蠊質量評價體系也至關重要。

4 結語

美洲大蠊作為傳統中藥材，已有上千年應用歷史，在臨床上有其獨特療效，國內外學者及大眾的關注日益增多，但目前尚未見統一的質量標準，也未見完善的質量評價體系來控制其整體質量，安全性、有效性、藥材的均一穩定性難以保證，因此完善并提高其質量評價體系迫在眉睫。美洲大蠊質量評價體系的建立應從品種鑒定、內在質量評價和安全性評價三方面著手，融合傳統評價方式與現代技術，形成科學有效的質量評價體系，必將進一步推進美洲大蠊藥材質量評價的科學與有效性，給臨床用藥的安全性、有效性提供保障。