加味丹參飲含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分泌bFGF、VEGF的影響

趙慧杰

(安鋼職工總醫(yī)院藥劑科,河南安陽 455004)

心血管疾病在臨床上屬于一類很常見的疾病，目前其已成為危害人類健康的重大疾病。據(jù)資料顯示[1]，40歲以上人群中冠心病發(fā)病率在4%～7%，并呈逐漸上升趨勢，其在心血管疾病中死亡率占50%左右。心肌梗死屬于冠心病中較嚴(yán)重的類型，臨床療效不夠理想，隨著對其研究的深入，其研究方向漸漸轉(zhuǎn)向移植治療，已有研究顯示[2]，心肌細(xì)胞移植可以作為治療重型心肌壞死的替代途徑。有研究顯示[3]，加味丹參飲能夠增強(qiáng)心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)模型大鼠的骨髓干細(xì)胞動員作用。也有文獻(xiàn)報(bào)道[4]，丹參、黃芪含藥血清能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal stem cells，BMSCs)增殖，本研究在此基礎(chǔ)上觀察加味丹參飲含藥血清對BMSCs增值率、分泌堿性成纖維生長因子(bFGF)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及儀器

Wistar大鼠均為健康雄性，SPF級，平均體質(zhì)量(235±25)g；SD大鼠32只，平均體質(zhì)量(255±15)g，平均周齡(12±1.3)周。購自南京正大天晴公司，動物合格證號：SYXK(蘇)2013-0018。

細(xì)胞培養(yǎng)箱、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、全自動酶標(biāo)儀分別由美國Shellab、Corning Costar、Bio-Rad公司提供；倒置相差顯微鏡由日本Olmpus公司提供；小型搖床由德國IKA公司提供。

1.2 溶液配制及試劑

加味丹參飲組方：丹參20 g、赤芍10 g、當(dāng)歸10 g、川芎10 g、紅花5 g、黃芪25 g、檀香5 g、生地15 g。將藥材混合浸泡后去渣，用水煎煮濃縮至1g/mL(含生藥)，保存?zhèn)溆谩Ｋ幰河砂蹭摽傖t(yī)院制劑室提供。

含藥血清制備：取SD大鼠32只，隨機(jī)分為A、B、C、D 4組(n=8)。根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中的動物、人體劑量折算系數(shù)表(根據(jù)成人最小劑量、常用劑量、最大劑量進(jìn)行折算)[4]，分別給予A、B、C組大鼠小劑量[5 g/(kg·d)]、常用量[10 g/(kg·d)]及最大劑量[15 g/(kg·d)]的加味丹參飲灌胃，連用5天，D組給予等量的生理鹽水灌胃5天。均第1天/1次。腹主動脈取血，離心10 min(3 000 rpm)，吸出上部血清，即得不同濃度加味丹參飲含藥血清及空白血清，保存于- 20℃的冰箱中備用。

青/鏈霉素雙抗(GBICO/BRL)、IMDM培養(yǎng)基(GBICO/BRL)、胎牛血清(FBS，由奧地利PAA提供)、胰蛋白酶(Trypsin，Sigma)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma)、大鼠bFGF、VEGF ELISA試劑盒由武漢博士德提供；MTT由美國Amersco提供。

1.3 方法

首先進(jìn)行BMSCs分離、培養(yǎng)、傳代。具體方法：頸椎脫臼將Wistar大鼠處死，用乙醇(75%)浸泡5 min，分層剝離(在無菌條件下)后肢皮膚及附著上面的肌肉，剪斷股骨、脛骨的骨骺端，用IMDM(含胎牛血清10%)培養(yǎng)液沖洗髓腔，過濾(用200鉬篩網(wǎng))，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，接種(5×106個(gè)/mL)，在CO2培養(yǎng)箱(37 ℃)中溫育。原代BMSDs培養(yǎng)每3天進(jìn)行1次換液，細(xì)胞接近80%(7～10天)鋪滿瓶底，用胰蛋白酶(濃度25%)、乙二胺四乙酸(EDTA，濃度0.02%)消化細(xì)胞，然后用5×105個(gè)/mL細(xì)胞接種在傳代培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)選用第3代MSCs做研究。

加味丹參飲含藥血清對BMSCs增殖的影響。取對數(shù)生長期BMSCs(第3代)用胰蛋白酶(濃度25%)、EDTA(濃度0.02%)消化，并在倒置的顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞略變圓時(shí)加入BMSCs完全培養(yǎng)基以終止消化，并用吸管輕輕吹打，細(xì)胞濃度調(diào)整至1.0×104個(gè)/mL，以每孔200 μL接種于4孔板內(nèi)。將每個(gè)培養(yǎng)板上接種的細(xì)胞也分為4組：加味丹參飲含藥血清小劑量組、中劑量組、大劑量組、空白對照組，每組均8個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)板分別在培養(yǎng)第1天、第2天、第3天后取出，將孔中培養(yǎng)液吸棄。加味丹參飲含藥血清組的孔中分別加入不同濃度加味丹參飲含藥血清BMSCs培養(yǎng)基，每孔為200 μL。而空白對照組每孔加入BMSCs完全培養(yǎng)基200 μL。培養(yǎng)板均在24 h后取出，然后每孔均加入MTT溶液20 μL，然后繼續(xù)孵育4 h后終止孵育，將孔中培養(yǎng)液吸棄，每孔中加入DMSO150 μL，振蕩10 min。最后檢測490 nm處的光吸收值(用全自動酶標(biāo)儀)，每板均重復(fù)2次，以平均值進(jìn)行對比分析。

加味丹參飲含藥血清對BMSCs分泌bFGF、VEGF的影響。取5×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于4孔板內(nèi)，均每孔接種1 mL，接種6個(gè)培養(yǎng)板。培養(yǎng)板在5%CO2培養(yǎng)箱中(濕度100%，37 ℃)培養(yǎng)第1天，將培養(yǎng)板取出，吸棄孔中的培養(yǎng)液，然后用PBS將每孔清洗3次，并將孔中PBS吸棄。根據(jù)不同組別加入不同濃度的加味丹參飲含藥血清及完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)板置入5%CO2培養(yǎng)箱中(濕度100%，37 ℃)培養(yǎng)，并在第1天、第2天、第3天時(shí)取出培養(yǎng)板2塊，將培養(yǎng)上清吸至不同EP管中，離心10 min(1 500 r/min)，收集上清，在-80 ℃條件下儲存?zhèn)溆谩５?天、第2天的樣品根據(jù)1∶2的比例稀釋后檢測；第3天的樣品根據(jù)1∶10的比例稀釋后檢測。每次均檢測3次，取平均值。其余操作均嚴(yán)格根據(jù)試劑盒中的說明書進(jìn)行。用全自動酶標(biāo)儀對各孔光吸收值進(jìn)行檢測。參考波長為630 nm，掃描波長為450 nm。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 加味丹參飲含藥血清對BMSCs增殖的影響

各組BMSCs增殖均隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而增強(qiáng)，第2天、第3天時(shí)分別與第1天時(shí)兩兩比較，P<0.01；誘導(dǎo)第1天時(shí)，加味丹參飲含藥血清各組均不能促進(jìn)BMSCs增殖，中、大劑量組與空白對照組比較，均明顯降低，P<0.01；誘導(dǎo)第2天、第3天時(shí)，加味丹參飲含藥血清中、大劑量組BMSCs增殖均明顯高于空白對照組，P<0.01。見表1。

組別劑量[g/(kg·d)]第1天第2天第3天空白對照組-0.20±0.0180.39±0.015a0.43±0.041a小劑量組50.19±0.0160.38±0.017a0.44±0.042a中劑量組100.17±0.015b0.64±0.014ab0.69±0.021ab大劑量組150.15±0.017b0.70±0.020ab0.74±0.022ab

注：與第1天時(shí)比較，aP<0.01；與空白對照組比較，bP<0.01。

2.2 加味丹參飲含藥血清對BMSCs分泌bFGF的影響

各組BMSCs分泌bFGF隨時(shí)間的增加而增加，第2天、第3天時(shí)分別與第1天時(shí)兩兩比較，P<0.01；在誘導(dǎo)第1天時(shí)，加味丹參飲含藥血清各組bFGF的分泌均未增加，小劑量組與空白對照組比較，明顯降低，P<0.01；誘導(dǎo)第2天、第3天時(shí)，加味丹參飲含藥血清中、大劑量組bFGF的分泌均明顯高于空白對照組，P<0.01。見表2。

組別劑量(g/kg·d)第1天第2天第3天空白對照組-329.15±11.181 068.75±22.35a2 501.28±42.51a小劑量組5187.17±12.06b952.38±12.47a2 308.47±13.42a中劑量組10290.65±15.011 690.01±21.24ab3 515.75±22.45ab大劑量組15356.72±13.271 791.70±11.39ab3 681.16±35.23ab

注：與第1天時(shí)比較，aP<0.01；與空白對照組比較，bP<0.01。

2.3 加味丹參飲含藥血清對BMSCs分泌VEGF的影響

各組VEGF分泌隨時(shí)間的增加而增加，誘導(dǎo)第2天、第3天時(shí)分別與第1天時(shí)兩兩比較，P<0.01；誘導(dǎo)第1天時(shí)，加味丹參飲含藥血清各組VEGF的分泌均未增加，小劑量組與空白對照組比較，還明顯降低，P<0.01；誘導(dǎo)第2天、第3天時(shí)，加味丹參飲含藥血清中、大劑量組VEGF的分泌均明顯高于空白對照組，P<0.01。見表3。

組別劑量[g/(kg·d)]第1天第2天第3天空白對照組-719.05±12.17975.28±24.62a2228.54±64.24a小劑量組5481.02±11.45b946.52±13.28a2215.54±58.51a中劑量組10741.38±10.631379.21±11.37ab2608.47±19.48ab大劑量組15756.91±10.721435.70±13.38ab2681.27±22.67ab

注：與第1天時(shí)比較，aP<0.01；與空白對照組比較，bP<0.01。

3 討論

bFGF為一種促血管生長因子，其在體內(nèi)外均有較強(qiáng)的促細(xì)胞增殖能力，VEGF則主要作用于血管形成的早期，主要促使原始血管形成。研究證實(shí)[4]，冠心病患者的冠狀動脈有狹窄時(shí)，缺血心肌的bFGF及VEGF等血管生長因子會明顯增加，與其相關(guān)的受體也會明顯上調(diào)，形成自發(fā)性新生血管，成立側(cè)支循環(huán)。但一般情況下，這種內(nèi)生性促血管生長因子的增多并不能建立豐富的側(cè)支循環(huán)以滿足代償性血液供應(yīng)，導(dǎo)致心肌缺血情況改善不明顯。如果促進(jìn)血管生長因子分泌，上調(diào)相關(guān)受體，則有可能增加新生血管生長的數(shù)量及生長速度，盡快建立有效側(cè)支循環(huán)，以滿足心臟血液供應(yīng)。研究證實(shí)[5-6]，BMSCs具有多分化潛能，也具有很大旁分泌及趨化功能，其能夠釋放多種細(xì)胞因子，以促進(jìn)血管新生，由此，BMSCs移植在冠心病的治療中廣泛應(yīng)用。

加味丹參飲由丹參、川芎、紅花、檀香等多種藥物組成，本方以丹參為君藥，用于活血化瘀，以黃芪、紅花、川芎等養(yǎng)血行氣，并加強(qiáng)活血化瘀的作用[7-8]；檀香則為佐藥，以行氣止痛。其在BMSCs移植治療中，能明顯改善微循環(huán)，增加冠脈的血流量，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建成，并使血液重新分布于心肌，使缺血心肌得到保護(hù)。本研究結(jié)果顯示，加味丹參飲含藥血清在誘導(dǎo)第1天時(shí)未能使BMSCs增殖增加，反而較空白對照組有所降低，這可能因細(xì)胞對外來藥物有一定的適應(yīng)期所致。但在誘導(dǎo)第2天、第3天時(shí)，中、大劑量組BMSCs增殖率明顯增加，分泌bFGF及VEGF明顯增高，且其隨時(shí)間的增加而有所增強(qiáng)。由此說明劑量為10 g/(kg·d)、15 g/(kg·d)的加味丹參飲血清能促進(jìn)BMSCs增殖，并能促進(jìn)BMSCs分泌bFGF及VEGF。此結(jié)果與李鑫輝等[9]的研究一致，這可能是因加味丹參飲含藥血清能促進(jìn)BMSCs的旁分泌有關(guān)[10]。對于加味丹參飲作用于BMSCs的作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，劑量為10 g/(kg·d)、15 g/(kg·d)的加味丹參飲含藥血清能促進(jìn)BMSCs增殖，并能促進(jìn)BMSCs分泌bFGF、VEGF。