基于HPLC指紋圖譜技術評價“虎杖葉藥材-虎杖葉膠囊”化學成分一致性研究

王 欣，覃 瑤，孫建彬，羅維早,*

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.太極集團有限公司，重慶 401147；3.成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都 610072)

虎杖葉為彝醫常用藥材，虎杖葉膠囊是以單味彝藥虎杖葉經提取制成的膠囊劑，兩者均能用于治療肝陽上亢引起的頭昏頭暈，即高血壓病[1]。HPLC指紋圖譜技術可用于中藥的化學成分一致性研究。本研究采用HPLC-UV指紋圖譜技術，分析比較兩者間的化學成分種類及數量，評價“虎杖葉藥材-虎杖葉膠囊”間化學成分的相似性，為虎杖葉及虎杖葉膠囊的進一步開發提供科學依據。

1材料

1.1 儀器

CPA225D型電子天平：十萬分之一，德國賽多利斯公司；KQ5200型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16G型離心機：上海安亭科學儀器廠；2010C HT型高效液相儀：紫外檢測器，LC-Solution色譜工作站，日本島津公司；2004年版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統。

1.2 試劑

乙腈：色譜純，美國TEDIA公司；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 對照品

蘆丁(100080-200707)、阿魏酸(10773-200611)、綠原酸(110753-200413)、異槲皮苷(111809-201403)、槲皮素(10081-9905)、白藜蘆醇(111535-200502)、虎杖苷(111575-200502)購自中檢所；大黃素甲醚(10104-201312)、大黃素(10103-201305)購自南昌貝塔生物科技有限公司；大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷(150810)、瑞諾苷(150904)、扁蓄苷(151217)、大黃素-1-O-β-D-葡萄糖苷(151108)購自四川省維克奇生物科技有限公司；金絲桃苷(J-012-150826)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；沒食子酸和咖啡酸為自制；槲皮苷購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.4 試藥

虎杖葉藥材共10批(Y007-15060102，湖北，S1；Y007-150602，湖南，S2；Y007-151001，四川，S3；Y007-150601，云南，S4；Y007-150602，云南，S5；Y007-15060101，江西，S6；Y007-150301，云南，S7；Y007-20161101，產地不詳，S8；Y007-20160902，產地不詳，S9；Y007-20160903，產地不詳，S10)。虎杖葉膠囊6批(批號：20151202，S11、20160401，S12、20160402，S13、20160403，S14、20161201，S15、20161203，S16)，均由云南龍海天然植物藥業有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 樣品制備方法

2.1.1 藥材溶液制備 取虎杖葉藥材粉末(過3號篩)0.50 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min(功率200 W，頻率40 kHz)，放冷，80%甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2 成品溶液制備 取虎杖葉膠囊內容物粉末0.10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min(功率200 W，頻率40 kHz)，放冷，甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：美國Phenomenex公司Gemini-NX C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μL。流動相為乙腈(A泵)-0.4%甲酸水溶液(B泵)，梯度條件：0～10 min(90%～87% B)，10～30 min(87%～85% B)，30～45 min(85%～84% B)，45～50 min(84%～80% B)，50～75 min(80%～75% B)，75～95 min(75%～70% B)，95～105 min(70%～35% B)，105～120 min(35%～30% B)，120～125 min(30%～5% B)。HPLC色譜見圖1、圖2。

1.沒食子酸；2.綠原酸；3.阿魏酸；4.虎杖苷；5.蘆丁；6.異槲皮苷；7.槲皮苷；

1.沒食子酸；2.綠原酸；3.阿魏酸；4.虎杖苷；5.蘆丁；6.異槲皮苷；

2.3 系統適應性試驗

取槲皮苷對照品溶液，按“2.2”項下方法測定，理論塔板數以槲皮苷計，不小于150 000。

2.4 方法學研究

前期研究中，虎杖葉藥材和虎杖葉膠囊指紋圖譜的方法學均符合相關要求[2-3]。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1樣品測定藥材(10批)和成藥(6批)，共計16批樣品，按“2.1”項下樣品制備方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，精密吸取各供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄125 min色譜，見圖1、圖2，對各樣品的HPLC圖譜中的色譜峰進行比較和編號，采用對照品保留時間比對，16批樣品的HPLC圖譜中標注了11個共有色譜峰，作為特征峰。16批樣品HPLC圖譜中11個特征峰的保留時間見表1。

表1 共有色譜峰保留時間 (min)

2.5.2內參照峰選定7號色譜峰為槲皮苷，該色譜峰分離度較好，無干擾，槲皮苷色譜峰峰面積占總峰面積的50%左右，故選定槲皮苷為內參照峰(S)。

2.5.3 HPLC指紋圖譜考察運用中華人民共和國國家藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版對16批樣品的HPLC指紋圖譜進行相似度分析，將HPLC數據導入中藥指紋圖譜相似度計算軟件中，以虎杖葉2號為參照譜，通過均值法計算得出樣品指紋圖譜的共有模式，各樣品指紋圖譜及共有模式見圖3。

圖3 16批樣品指紋圖譜與對照譜

2.5.3 相似度評價以“2.5”項下建立的對照譜為標準，對16批樣品進行相似度評價，見表2，從表2可知，除虎杖葉3號藥材外，其余15批樣品的相似度值均大于0.980，說明藥材與成品之間化學成分一致性較好。虎杖葉3號藥材的槲皮苷含量低，而槲皮素含量高，原因可能為：虎杖葉3號藥材在儲存、運輸等過程中，藥材中槲皮苷已被降解成槲皮素。

表2 16批樣品相似度結果

3 討論

HPLC指紋圖譜研究發現，藥材中槲皮素的含量低，而成品中槲皮素的含量高，其影響因素有2個：①虎杖葉膠囊提取工藝中的轉移率；②虎杖葉膠囊生產過程中，虎杖葉藥材中的黃酮苷成分(槲皮苷、異槲皮苷、蘆丁、瑞諾苷、扁蓄苷及金絲桃苷等)降解為槲皮素苷元。

前期對虎杖葉藥材及虎杖葉膠囊的化學成分研究發現，其主要成分為酚酸、黃酮及蒽醌等酸性成分[4-5]，HPLC流動相選用甲酸優化峰型，乙腈的分離效果優于甲醇，即HPLC流動相體系選定為乙腈-0.4%甲酸水溶液，梯度洗脫125 min可使大部分的色譜峰得到基線分離；當柱溫為20 ℃時，各成分間的分離效果最好；檢測波長為270 nm時，HPLC圖譜中色譜峰信息最豐富。