HPLC-DAD法建立加味滋膵膠囊指紋圖譜研究

冉亞東，原歡歡，禹奇男，彭世陸，蔣燕霞，劉世琪，彭濤，秦少容，董自亮

(太極集團(tuán)有限公司，重慶 408000)

滋膵飲出自清·張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由黃芪、生地黃、山藥、山萸肉、生豬胰子組成，具有滋補(bǔ)膵臟、益脾固腎之功效，主治消渴。加味滋膵飲為卿玉玲主任醫(yī)師在大量臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上，去方中豬胰子，加莪術(shù)、益母草、丹參、大黃而成。組方具有養(yǎng)陰益氣、活血通絡(luò)的功能，用于治療氣陰兩虛、血瘀所致消渴，癥見腰膝酸軟、口渴喜飲、神疲氣短、小便量多渾濁、舌質(zhì)暗淡、舌苔薄白、脈細(xì)無力、糖尿病腎病見上述癥狀者。本課題組將其開發(fā)成生物利用度高、順應(yīng)性好、攜帶方便的現(xiàn)代制劑加味滋膵膠囊。

中藥指紋圖譜是評(píng)價(jià)含有多種組分中藥復(fù)方質(zhì)量的有效手段，具有專屬性、整體性和模糊性等特點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)在于盡可能全面地反映復(fù)方中的化學(xué)成分及其相對(duì)比例，保證中藥及其制劑的穩(wěn)定性和可靠性，已得到國(guó)內(nèi)外普遍認(rèn)可[1-2]。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，通過HPLC-DAD 法首次建立加味滋膵膠囊的指紋圖譜，以期控制該復(fù)方制劑的質(zhì)量，為該復(fù)方制劑的開發(fā)提供參考。

1 儀器及試藥

Agilent 1100系列液相色譜儀(Agilent公司)，Agilent色譜工作站；BP211型分析天平；HDM調(diào)溫電熱套金壇市華峰儀器設(shè)備有限公司)；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

黃芪、山茱萸、丹參、山藥等藥材均購(gòu)自安徽亳州市場(chǎng)，經(jīng)太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司質(zhì)檢中心楊修齊研究員鑒定符合藥典要求。

乙腈、甲酸為色譜純，水為超純水，其余均為分析純。馬錢苷對(duì)照品(批號(hào)111640-201507，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.01%甲酸水；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；柱溫：27 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液制備

精密稱取加味滋膵膠囊0.25 g，以40 mL水復(fù)溶，用95%乙醇調(diào)整醇含量至75%，均勻攪拌，靜置6 h，離心(20 min，3 000 r·min-1)，用75%乙醇洗滌沉淀2次，離心(20 min，3 000 r·min-1)，合并上清，減壓濃縮除去乙醇，將得到的提取物冷凍干燥，得到加味滋膵膠囊指紋圖譜樣品。

2.3 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取馬錢苷對(duì)照品適量，用甲醇溶解，配制成馬錢苷濃度為65 μg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 指紋圖譜專屬性檢測(cè)

精密稱定加味滋膵膠囊樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)樣品，記錄各樣品內(nèi)色譜峰、保留時(shí)間、峰面積。分別精密吸取空白溶劑、樣品溶液注入HPLC儀中，記錄色譜與各標(biāo)示峰的光譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在該條件下空白無干擾。詳見圖1、圖2。

圖1 空白溶劑指紋圖譜

圖2 樣品指紋圖譜及光譜識(shí)別

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品(批號(hào)：170801)，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。以重現(xiàn)性與分離度均好的11號(hào)峰(馬錢苷峰)為參照峰(S)，考察膠囊指紋圖譜各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積RSD值，結(jié)果見表2、表3，由表可知，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.92%，相對(duì)峰面積RSD均小于4.36%，精密度良好，表明儀器性能穩(wěn)定。

表2 指紋圖譜精密度相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表3 指紋圖譜精密度相對(duì)峰面積結(jié)果

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品(批號(hào)：170801)，按照“2.2”項(xiàng)下取供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以重現(xiàn)性、分離度均好的11號(hào)峰(馬錢苷峰)為參照峰(S)，考察膠囊指紋圖譜各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積RSD值，見表4、表5，由表可知，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.47%，相對(duì)峰面積RSD均小于8.11%，表明該方法重復(fù)性良好。

表4 指紋圖譜重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表5 指紋圖譜重復(fù)性相對(duì)峰面積結(jié)果

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品(批號(hào)：170801)，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，在0、4、5、12、16、20、24 h分別進(jìn)樣，以重現(xiàn)性、分離度均好的11號(hào)峰(馬錢苷峰)為參照峰(S)，考察膠囊指紋圖譜各個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積RSD，見表6、表7，結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.82%，相對(duì)峰面積RSD均小于9.09%，可判斷樣品24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表6 指紋圖譜穩(wěn)定性相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表7 指紋圖譜穩(wěn)定性相對(duì)峰面積結(jié)果

2.6 指紋圖譜共有模式的建立及相似度分析

精密吸取18批加味滋膵膠囊樣品，按照“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，取20 μL注入色譜儀，并記錄120 min內(nèi)的色譜圖。

采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件，生成共有模式的對(duì)照指紋圖譜(圖3)，不同批次樣品共有色譜峰13個(gè)。18批樣品的相似度在0.951～0.998之間(S1～S18相似度值分別為0.977、0.994、0.994、0.995、0.992、0.998、0.997、0.990、0.955、0.994、0.951、0.991、0.988、0.997、0.997、0.994、0.997、0.998)，相似度高，符合指紋圖譜相關(guān)要求。

圖3 18批加味滋膵膠囊樣品指紋圖譜疊加

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了190～400 nm全波長(zhǎng)掃描、全波長(zhǎng)掃描提取278 nm、278 nm單波長(zhǎng)、全波長(zhǎng)掃描提取210 nm、全波長(zhǎng)掃描提取207 nm等5種掃描方式，結(jié)果從譜峰的分離度上看，278 nm單波長(zhǎng)效果較佳，且在該波長(zhǎng)下譜峰信息最豐富。故選擇278 nm單波長(zhǎng)掃描方式。

本實(shí)驗(yàn)考察乙腈-0.01%甲酸水；甲醇-0.01%磷酸水；乙腈-0.01%磷酸水；乙腈-水；乙腈-0.1%磷酸水5種不同的流動(dòng)相,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入酸可以優(yōu)化峰形，但隨著酸濃度的增加，色譜峰的分離度并沒有實(shí)質(zhì)性變化，乙腈-0.01%磷酸水和乙腈-0.01%甲酸水色譜圖無明顯差異，甲醇-0.01%磷酸水色譜峰較寬，且若想達(dá)到較好的分離效果，可能需要較長(zhǎng)的分析時(shí)間。綜合上述分析，最終流動(dòng)相選擇乙腈-0.01%甲酸水。

綜上所述，本試驗(yàn)采用HPLC-DAD建立的加味滋膵膠囊指紋圖譜，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定；方法學(xué)考察表明重復(fù)性、穩(wěn)定性好，精密度均符合要求；采用相似度軟件分析樣品，計(jì)算出的相似度較高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法成熟，各樣品批間一致性較好，可用于加味滋膵膠囊的質(zhì)量控制。