CSFV、PRRSV和PCV2多重PCR檢測方法的建立及初步應用

蘭世捷 陳 亮 苗 艷馮萬宇 王志強 朱慶賀 金振華 李 陽 徐 馨 李 丹

（黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾 161005）

豬繁殖障礙性疾病是危害養豬場尤其是種豬場最為嚴重的疾病之一，妊娠母豬流產、早產，初生仔豬免疫力差，往往出現弱胎、死胎和木乃伊胎，也有的母豬發生隱性感染不表現任何臨床癥狀[1]。由于母豬的繁殖障礙類疾病隱蔽性強，可發于妊娠期的任何時間，發病豬既能通過環境將其傳給其他健康豬，也可通過胎盤將病毒垂直傳給胎兒，導致健康豬和新生仔豬發生該類疾病[2]。繁殖障礙類疾病中以豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬圓環病毒2型（PCV2）常見[1]，發生這3種疾病的臨床癥狀極為相似。近年來，母豬繁殖疾病以多個病毒混合感染較常見，單純依據臨床癥狀很難做出確切診斷，傳統的血清學、免疫學診斷方法存在操作繁瑣、周期長、敏感度差以及檢測耗時長等缺點，無法滿足目前實驗室和臨床大批量檢測[3]。

多重PCR（multiplex PCR，mPCR），也稱為多重引物PCR或者復合PCR，它是在同一個PCR反應體系中加入2對或2對以上引物，從而同時擴增出多個基因片段的PCR反應，也是近些年人類醫學、生物醫學和動物醫學常用的一種分子生物學檢測手段。mPCR法具有檢測靈敏性高、時間短、節省材料、節約經費等優勢，可通過一次反應檢測出多個病原，更適合于多種病原混合感染的精確快速診斷[4]。基于獸醫科研和臨床的需要，且為豬病檢測提供一種新的手段，本研究利用多重PCR法建立了一種可以同時檢測豬CSFV、PRRSV和PCV2等病毒的新方法。實驗室及臨床試驗表明，該方法操作簡單快速、準確性高、時間短，可以一次檢測3種病毒，做到確切診斷，為豬繁殖障礙性疾病診斷提供新的手段[5]，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和陽性對照

豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2型的陽性毒株均購自上海海利生物技術股份有限公司。

1.1.2 樣品來源

豬的病料樣品采集于2016—2018年間黑龍江省齊齊哈爾市周邊縣區及臨近內蒙古自治區部分豬場，采集臨床表現疑似繁殖障礙疾病的母豬內臟、淋巴結活體組織。每頭豬的各組織混合成1份病料。

1.1.3 主要試劑

Trizol Reagent購自Invitrogen公司；dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、5×RT Buffer及M-MLV酶和RNA酶抑制劑購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖購于Biowest公司；DNA及RNA提取試劑盒購于北京世紀元亨動物防疫技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成

根據GenBank中PRRSV、CSFV 和PCV2的標準參考毒株基因組序列選擇保守基因，分別選擇PRRSV的ORF7基因、CSFV的E2基因和PCV2的ORF2基因做為擴增靶序列，應用Primer 5.0和Oligo 7.0軟件設計3對特異性引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用ddH2O稀釋，－20℃保存備用，見表1。

表1 多重RT-PCR引物設計結果

1.2.2 DNA和RNA的提取

取疑似病豬的心、肺、脾和淋巴結組織，分別剪取每個組織不同位置的樣品放在研磨器中研磨，同時加入適量的生理鹽水勻漿后，置于－20℃反復凍融3次，8 000 rpm/min離心3 min，取上清液于1.5 mL滅菌離心管中，分別按照北京世紀元亨動物防疫技術有限公司生產的DNA/RNA提取試劑盒說明書進行操作。將提取好的DNA/RNA檢測合格后，置于－20℃保存備用。

1.2.3 RNA病毒模板的制備

取提取好的PRRSV和CSFV的RNA，按照反轉錄試劑說明書進行反轉錄。反應體系為20 μL，其中RNA模板 6 μL、random primers 1 μL、2.5 mM dNTP 4 μL、ddH2O 1 μL、65℃ 5 min，冰浴 30 s；buffer 4 μL、0.1 M DTT 2 μL、酶抑制劑 1 μL、37℃ 2 min；MLV 1μL、25℃ 10 min、37℃ 1.5 h、70℃ 13 min。反轉錄得到的cDNA檢測合格后，置于－20℃保存備用。

1.2.4 單項PCR檢測方法的建立

根據引物濃度，退火溫度條件反復試驗最后確定單項PCR最佳反應條件。單項PCR的反應總體系25 μL，取DNA或反轉錄得到的cDNA模板各2 μL、2.5 mM dNTP 2 μL、10×PCR Buffer（Mg2+） 2.5 μL、上下游引物各 0.5 μL、Taq 0.125 μL，加 ddH2O 補足 25 μL。單項PCR擴增程序按以下步驟：94℃2 min、94℃30 s、54℃30s、72℃1min20s，32個循環，72℃延伸10min。

1.2.5 多重PCR檢測方法的建立

以PCV2、CSFV和PRRSV單項PCR反應為基礎，對多重PCR各項條件進行優化。多重PCR的反應體積為 25 μL：其中，2.5 mM dNTP 2 μL、10×PCR Buffer（Mg2+） 2.5 μL，模板各1.5 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq0.125 μL，然后加 ddH2O 補足 25 μL。按以下步驟進行PCR擴增：94℃2 min、94℃30 s、54℃30 s、72℃1 min 20 s，32個循環，72℃延伸10 min。

1.2.6 多重PCR擴增條件的優化

以提取的DNA和cDNA為模板，采用50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃進行PCR擴增，優化退火溫度，確定多重PCR擴增最佳退火溫度。

1.2.7 多重PCR靈敏性試驗

將已知濃度3種病毒核酸混合，用ddH2O做10倍稀釋，取每個稀釋度的模板進行PCR。

1.2.8 多重PCR特異性試驗

采用優化后的PCR體系及程序，分別以CSFV、PRRSV和PCV2，以及3種病毒的DNA或cDNA的混合物為模板；同時，以PRV、PPV、PEDV為陽性對照，以滅菌雙氧水為陰性對照，用1.2.5反應體系和程序進行多重PCR。

1.2.9 重復性試驗

應用建立的多重PCR，用1.2.5反應體系和程序重復檢測的CSFV、PRRSV和PCV2的單一病毒的cDNA或DNA以及DNA與cDNA的混合樣品3次，檢驗結果的可靠性。

2 結果

2.1 PCR擴增

用合成的3對引物分別對CSFV、PRRSV、PCV2進行單項及多重PCR擴增，擴增結果如圖1，可觀察到204 bp（CSFV）、314bp（PRRSV）、485bp（PCV2）的目的條帶，大小與預期相符，陰性對照沒有擴增出條帶。

圖1 單一PCR擴增和多重PCR擴增

2.2 多重PCR退火溫度的優化

選取不同的退火溫度（50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃）進行多重PCR反應。結果顯示，不同退火溫度對擴增結果影響不大，最終選擇54℃作為多重PCR最佳退火溫度（圖2）。

2.3 靈敏性檢驗結果

采用優化后的條件來擴增10倍稀釋的CSFV、PRRSV和PCV2的cDNA和DNA混合液，測得的多重PCR的最低檢測量分別為39.3 pg、55.1 pg和1.32 pg（見圖 3）。

圖2 多重PCR退火溫度的優化

圖3 多重PCR敏感性擴增結果

2.4 特異性檢驗結果

按照已優化的多重PCR反應體系進行特異性試驗。結果顯示，PRV、PPV和PEDV及陰性對照均未擴增出條帶，CSFV、PRRSV和PCV2及3種混合模板可見清晰的條帶。通過測序鑒定：這些條帶均為目的片段，說明該PCR的特異性較好。

2.5 重復性試驗結果

用建立的多重PCR在不同時間對每份陽性樣品重復檢測3次，結果均一致。說明建立的多重PCR具有較好的穩定性。

圖4 多重RT-PCR的特異性擴增結果

2.6 多重PCR對臨床樣品的檢測結果

對96份疑似繁殖障礙病的母豬組織樣品進行多重PCR檢測，結果顯示，8份樣品檢出CSFV，24份樣品檢出PRRSV，75份樣品檢出PCV2；其中24份樣品為PCV2和PRRSV混合感染，8份樣品為PCV2和CSFV的混合感染。多重PCR檢測結果與單一RT-PCR檢測結果完全相符（表2）。

表2 96份病豬樣品經多重PCR及單一PCR的檢測結果

3 討論

近年來，文獻及臨床病料檢測結果表明，規?；i場所發生的母豬繁殖障礙性疾病大多為混合感染[6]，此類疾病中CSFV、PRRSV和PCV2是較為常見的病原，其中PCV2在豬場中普遍存在，臨床檢測陽性率極高。

多重PCR反應中，引物設計的好壞決定著多重PCR反應的成敗[3]。設計引物時，所選基因片段中G＋C含量應在55%～60%，引物長度為20～21 bp，所擴增的基因片段長度容易區分，退火溫度相近，以確保不同引物在同一溫度下均能擴增成功，并便于瓊脂糖凝膠電泳的觀察分辨。應用多重PCR方法對96份可疑病料進行檢測，結果表明，在檢查的96份病料中，PCV2與PRRSV混合感染占比為25%，PCV2與CSFV混合感染占比為8.33%，PCV2、PRRSV和CSFV 3者混合感染占比為1.04%。說明目前3種病毒對豬群的感染率較高，且多以混合感染為主。

圖5 多重PCR對部分臨床樣品的檢測

4 小結

試驗通過自行設計3對引物，建立了同時檢測PCV2、PRRSV和CSFV 3種病毒的多重PCR，該PCR可同時擴增出204 bp（CSFV）、314 bp（PRRSV）和485 bp（PCV2）的目的條帶，為3種病毒檢測增加了一個新的渠道。該檢測方法對種豬場的實時監控、凈化種豬群和推廣優良種豬具有重要意義[3]。