豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測方法的建立及應用

楊永能

（云南省楚雄彝族自治州動物疫病預防控制中心，云南楚雄 675000）

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是世界范圍的豬病，給養豬業帶來了嚴重的經濟損失。為有效地預防和控制該病，建立一種快速、靈敏又特異的檢測方法勢在必行。目前，國內診斷該病的方法大多是采用細菌分離鑒定和血清學診斷，細菌分離鑒定費時、費力、過程繁瑣且有時分離不到致病菌；血清學診斷雖然簡便、快速，但有其局限性，如亞臨床感染或帶菌狀態下易造成假陰性，對免疫豬和感染豬不能做出有效的鑒別診斷。豬傳染性胸膜肺炎有15個血清型，目前，雖然已建立了以胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP） APXI、APXII、APXIII及OMP等某一DNA片段為目標基因的PCR診斷方法，但與胸膜肺炎放線桿菌相近的菌屬較多，且也存在這些目標基因或者與目標基因差別極小的基因片段，在進行PCR擴增時，偶爾會出現假陽性，造成誤診。APXIVA基因與APXI、APXII、APXIII基因不同，APXI、APXII、APXIII等基因只存在于部分血清型的胸膜肺炎放線桿菌中，APXIVA則存在于所有血清型中。據報道，以放線桿菌所有的15個血清型菌株為模板，用PCR方法都能擴增出APXIVA片段，而從其他親緣關系相近的細菌中無法擴增出這一片段，說明該片段具有很高的種屬特異性。以APXIVA基因某一DNA片段為目標基因建立PCR診斷方法，有利于疾病發生時的快速診斷和流行病學調查，具有廣闊的應用前景和實用價值。

1 試驗材料與方法

1.1 菌株來源

標準菌株：傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型2型和5型標準菌株和副豬嗜血桿菌菌株購自中國獸醫藥品監察所微生物菌種保藏中心。分離菌株和對照菌株（鏈球菌、巴氏桿菌、大腸桿菌）均由云南農業大學動物醫學院實驗教學中心提供。

1.2 試驗設備

高壓鍋、超凈臺、冰箱、恒溫培養箱、PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統、移液槍、水浴鍋、離心管、顯微鏡、載玻片等由云南農業大學動物醫學院實驗教學中心提供。

1.3 試驗材料及試劑

還原型輔酶A、巧克力瓊脂培養基、PPLO瓊脂培養基、脲酶、觸酶、七葉苷、水楊苷、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、海藻糖等均由云南農業大學動物醫學院實驗教學中心提供。2×Trans HiFi MixⅡ、dNTP購自大連寶生物技術服務有限公司。

1.4 引物的設計與合成

根據 Nahuel和 Alain等[2，3]報告的 APXIVA 基因序列，針對目前主要流行的血清型設計出一對特異性引物，并提交上海生工生物技術服務有限公司合成。

2 試驗步驟

2.1 DNA提取

分別取傳染性胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌標準菌株菌液1.5 mL。于12 000 rpm離心1 min，棄上清，根據上海生工生物技術服務有限公司細菌總DNA抽提試劑盒進行細菌的DNA提取，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取情況，陽性DNA則于- 20℃保存備用。

表1 引物序列

2.2 PCR體系及反應條件優化

利用提取的傳染性胸膜肺炎放線桿菌標準菌株DNA作為模板，對PCR反應體系及條件進行優化，經多次試驗摸索和優化，最終確立最佳PCR反應體系和條件分別為：

⑴第1輪PCR反應（外鏈擴增）體系及條件（擴增條帶為442 bp）：

表2 第1輪PCR反應的PCR擴增體系

第1輪PCR反應（外鏈）擴增程序為：①94℃預變性5 min，②94℃變性30 s，③52℃退火30 s，④72℃延伸30 s，進行35個循環，⑤72℃延伸5 min。

⑵ 第2輪PCR反應（內鏈）擴增體系及條件（擴增條帶為378 bp）：

表3 第2輪PCR反應的PCR擴增體系

第2輪PCR反應（內鏈）擴增程序為：①95℃預變性5 min，②94℃變性30 s，③52℃退火30 s，④72℃延伸30s，進行35個循環，⑤72℃延伸5 min。

取10 μL PCR擴增產物與6×Loading Buffer混合均勻后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠（含0.2%EB）孔中，并在100 V電壓下電泳40 min，在凝膠成像系統上觀察結果，并拍照。

2.3 PCR特異性測定

分別用與呼吸道有關的病原菌（鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和大腸桿菌）作為模板，按上述相同方法進行PCR擴增，觀察電泳結果。

2.4 PCR靈敏性檢測

分別挑取傳染性胸膜肺炎放線桿菌標準菌株血清型2型和血清型5型接種于液體培養基中，37℃震蕩培養24 h后；取0.2 mL菌液加1.8 mL PBS液混勻稀釋后作為第1管，從第1管中取0.2 mL菌液加1.8 mL PBS液混勻稀釋后作為第2管，從第2管中取0.2 mL菌液加1.8 mL PBS液混勻稀釋后作為第3管……依次往下（10倍稀釋）稀釋至第8管。分別從稀釋好的各管中取出1 mL，用上述所建的檢測方法對其進行檢測，觀察電泳結果。并用核酸定量儀測定各管中菌液的濃度。

2.5 PCR檢測方法的實際應用

對云南各地送檢的7份疑似傳染性胸膜肺炎感染的病料采用細菌分離生化鑒定方法及上述所建的PCR檢測方法進行檢測，比較所建的PCR檢測方法與細菌分離生化鑒定法的符合率。

3 試驗結果

3.1 細菌DNA的提取

將放線桿菌血清型2型和5型標準菌株及放線桿菌地方流行毒株提取后的DNA進行電泳檢測，確定已抽提出DNA。

3.2 第1輪 （外鏈擴增）和第2輪 （內鏈擴增）PCR反應的優化

利用提取的傳染性胸膜肺炎放線桿菌標準菌株和地方流行株DNA作模板，對PCR反應體系及條件進行優化，經多次試驗和優化，最終確立第1輪最佳PCR反應并擴增出442 bp條帶（圖1），第2輪最佳PCR反應并擴增出378 bp條帶（圖2）。

圖1 菌株第1輪PCR產物電泳鑒定結果

圖2 菌株第2輪PCR產物電泳鑒定結果

3.3 PCR特異性測定

以鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌以及大腸桿菌的DNA為模板進行PCR擴增，結果顯示，2對引物只能對傳染性胸膜肺炎放線桿菌擴增出378 bp和442 bp的目的片段（見圖3）。

3.4 PCR靈敏性檢測

從稀釋好的菌液中取1 mL用上述所建的檢測方法進行檢測，并測得原濃度（未稀釋）菌液濃度為4.8×108個/mL，且第1輪PCR檢出率為480個/mL（見圖4）；第2輪PCR最低檢出率為48個/mL（見圖5）。

圖3 參考菌株電泳鑒定結果

圖4 標準菌株第1輪PCR產物電泳鑒定結果

3.5 PCR方法與經典病原學方法對病料的檢測結果對比

對各養殖場送檢的7份疑似傳染性胸膜肺炎感染的病料分別采用細菌分離生化鑒定和PCR檢測，結果均檢測出其中2份病料為傳染性胸膜肺炎放線桿菌陽性，其余均未檢測到傳染性胸膜肺炎放線桿菌（見圖6、圖7）。PCR檢測法與細菌分離生化鑒定檢測法的符合率為100%。

圖5 標準菌株第2輪PCR產物電泳鑒定結果

圖6 病料2電泳鑒定結果

圖7 病料6和7電泳鑒定結果

4 討論

建立的PCR檢測方法在送檢的7種病料中未檢測出鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和大腸桿菌等病原，利用此檢測方法能夠檢測到最低含量為48個/mL的細菌濃度。說明建立快速、靈敏、高通量的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌PCR診斷方法，可以為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的檢測提供一種確實有效的診斷方法。對采集的病料分離培養鑒定和病料提取DNA進行PCR擴增后二者結果符合率為100%。