食品中多種水溶性維生素快速檢測的方法研究

詹越城 ， 何 斌 ， 劉夢婷 ，楊 娜 ， 裘鈞陶 ， 鐘世歡 ，汪慶旗 ， 楊 琳

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江 杭州 310009；2.贊宇科技集團股份有限公司，浙江 杭州 310009）

水溶性維生素是維持人體正常生命活動不可缺少且需求量較少的一類有機化合物，其中一些維生素在人體內不能合成或者合成的量不能滿足人體的需要，必須由食物供給，但是水溶性維生素攝入過量或缺乏都將導致各種疾病[1]。目前，很多食品中都會添加水溶性維生素，但其是否符合要求還有待進一步檢測驗證。因此，加大對水溶性維生素檢測技術的研究，快速檢測食品中水溶性維生素含量，對于人們科學攝入水溶性維生素具有一定的指導意義，同時，對于科學控制水溶性維生素在食品中的添加量也具有重要意義。

目前，我國國標只對單一或者2～3種水溶性維生素進行檢測，其中牛磺酸、維B1（硫胺素）、維B2（核黃素）、維B3（煙酸、煙酰胺）、維B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺） 主要用高效液相色譜測定；維B5（泛酸）、維B9（葉酸）、維B12（鈷胺素） 和維H（生物素） 主要用微生物法測定。這些方法前處理繁瑣、檢測周期長、成本高，不能滿足多種物質快速同時檢測的要求[2]。所以試驗擬運用HPLC-MS/MS聯用技術，建立同時檢測食品中12種水溶性維生素（牛磺酸、維B1、維B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、葉酸、維B12、生物素） 的快速檢驗方法，針對不同樣品的前處理進行優(yōu)化，可大大提高檢測效率，對于科學控制水溶性維生素在食品中的添加量具有重要意義[3]。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

除非另有說明，所有試劑均為分析純；水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

乙腈 （色譜純），美國Tedia公司提供；甲酸（優(yōu)級純），上海安譜科學儀器有限公司提供；乙酸銨、冰乙酸、鹽酸、三氯乙酸（分析純），杭州化學試劑有限公司提供；牛磺酸、維B1、維B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、葉酸、維B12、生物素標準物質 （含量≥99%），Dr.Ehrenstorfer公司提供。

標準溶液的配置：牛磺酸、維B1、維B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、維B12、生物素標準物質各稱取0.05 g至50.00 mL容量瓶，用0.01 mol/L鹽酸定容，配制成1 000μg/mL標準儲備液，葉酸稱取0.05 g至50.00 mL容量瓶，用少量稀氨水溶解后，再用濃度為0.01 mol/L鹽酸定容，配制成1 000μg/mL標準儲備液。再用水稀釋成適當質量濃度的混合標準工作液。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 InfinityⅡ型超高效液相色譜儀（配備二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱等）；Agilent 6470型三重四極桿質譜儀；TGL-16G型高速離心機，上海安亭科學儀器廠產品；Milli-Q型純水儀，美國Millpore公司產品。

1.3 分析步驟

1.3.1 樣品前處理

（1） 果汁飲料。 稱取試樣5 g（ 精確至0.01） 于100 mL容量瓶中，用濃度為0.01 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，混勻，用0.22μm微孔濾膜過濾后，供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

（2） 含乳飲料。 稱取試樣5 g（ 精確至0.01） 于100 mL容量瓶中，加入10 mL質量濃度為40 g/L三氯乙酸溶液，混勻，超聲提取20 min，用水定容至刻度，取適量溶液以轉速4 000 r/min離心5 min。取上清液用0.22μm微孔濾膜過濾后，供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

（3） 奶粉。 稱取試樣1 g（精確至0.01） 于100 mL容量瓶中，加入50 mL 45～50℃的水溶解，混勻后超聲處理30 min，待溶液溫度降至室溫后，用冰乙酸調節(jié)pH值至4.50左右，用水定容至刻度，取適量溶液以轉速4 000 r/min離心5 min。取上清液用0.22μm微孔濾膜過濾后，供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

1.3.2 測定

（1） 色譜柱。Agilent SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm， USA）。

柱溫35℃，進樣體積5μL，流速0.3 mL/min，流動相A為濃度5 mmol/L乙酸銨，流動相B為乙腈。

梯度洗脫程序見表1。

（2） 質譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子，檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM）方式采集，毛細管電壓4.0 kV，霧化器 （N2） 壓力45 psi； 干燥氣 （N2） 溫度 350℃， 干燥氣 （N2） 流速10 L/min。

表1 梯度洗脫程序

12種水溶性維生素的質譜檢測參數見表2，12種水溶性維生素MRM色譜圖見圖1。

表2 12種水溶性維生素的質譜檢測參數

2 結果與分析[6-8]

2.1 線性關系和檢測限

將標準溶液工作液按由低到高質量濃度進樣，在上述儀器條件下測定，分別以質量濃度為橫坐標、以對應的峰面積為縱坐標繪制，標準曲線得到線性方程。

12種水溶性維生素線性及檢出限見表3。

由表3可知，12種水溶性維生素在各自標準曲線質量濃度范圍內線性良好。

2.2 精密度和回收率

對3種不同基質樣品分別進行3個質量濃度水平6次加標回收試驗，考查精密度和回收率。

圖1 12種水溶性維生素MRM色譜圖

表3 12種水溶性維生素線性及檢出限

12種水溶性維生素精密度及回收率試驗見表4。

由表4可知，12種水溶性維生素加標樣品回收率為78.5%～89.4%，相對標準偏差（RSD） 為2.00%～4.99%，該方法具有較好的精密度，能滿足實際樣品的檢測需要。

2.3 結果計算和表達

試樣中目標物的含量X，以μg/kg表示，按式計算：

式中：C——試樣溶液的質量濃度，ng/mL；

V——試樣溶液的體積，mL；

m——試樣的質量，g；

n——樣液稀釋倍數。

注：測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留3位有效數字。

3 結論

12種水溶性維生素在相應質量濃度范圍內線性良好，相關系數均大于0.999，不同樣品基質中（果汁飲料、乳飲料、奶粉） 在3個質量濃度水平加標試驗回收率在78.5%～89.4%，相對標準偏差（RSD） 為2.00%～4.99%， 方法檢測限 （LOD，S/N≥3）為 5.0μg/kg，定量限為20.0μg/kg。經方法學驗證，該方法簡便快速、重現性好、靈敏度高、結果可靠，適用于食品中12種水溶性維生素的快速篩查和定量測定。

超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）同時測定食品中牛磺酸、維B1、維B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、葉酸、維B12、生物素的方法。樣品用水提取，提取液離心過濾后動態(tài)多反應監(jiān)測方式測定。與目前的國家標準和文獻報道的方法相比，該方法在保證準確性好、靈敏度高的同時，盡可能省去了復雜的前處理，為食品中同時快速測定多種維生素的研究提供了數據和基礎。

表4 12種水溶性維生素精密度及回收率試驗