海藻糖和甘露醇對凍融循環(huán)引起的蝦蛄肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性變化的影響

陳金玉，李 彬，何麗麗，梁喚喚，韋英霞，韓業(yè)勤，張坤生*

（天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

冷凍貯藏是原料肉和肉制品保鮮貯藏的主要方式。在低溫條件下微生物和酶活性受到抑制，但是肌肉品質(zhì)的劣變?nèi)匀粺o法避免。尤其目前我國冷鏈技術(shù)尚不完善，在肉品的長途運輸、貯藏及消費過程中，由于溫度波動不可避免地出現(xiàn)反復(fù)凍融現(xiàn)象。肉在反復(fù)凍融過程中會發(fā)生肉質(zhì)硬化、柔軟性下降、持水力降低、組織纖維化等變化，產(chǎn)生這些現(xiàn)象的根本原因是肌原纖維蛋白的變性[1]。肌原纖維蛋白是由肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白、輔肌動蛋白等所組成的鹽溶性蛋白。反復(fù)凍融使樣品中小冰晶體重結(jié)晶，從而在肌原纖維中重新分布，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)被破壞，肌原纖維蛋白變性，降低肉產(chǎn)品的食用價值[2]。因此研究反復(fù)凍融對肌肉品質(zhì)的影響以及控制肉蛋白冷凍變性具有重要的現(xiàn)實意義。

冷凍變性保護劑又稱抗凍劑，是目前防止蛋白冷凍變性的最主要方法。保護劑的種類很多，蔗糖因其價格低廉、抗凍效果較好且不易發(fā)生美拉德反應(yīng)而廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中，但此類抗凍劑甜度和熱量相對較高，與當(dāng)前人們對健康飲食的追求不太相符，因此低甜度、低熱量的抗凍劑成為新的研究對象。目前海藻糖和甘露醇作為低熱量功能性糖醇類抗凍劑受到越來越多關(guān)注。Sei等[3]發(fā)現(xiàn)海藻糖在抑制冰晶增長和冰晶形態(tài)不穩(wěn)定方面，比蔗糖更具優(yōu)勢。薛勇等[4]采用10%海藻糖作為抗凍劑，測定凍藏后鳙魚肌原纖維蛋白性質(zhì)的變化，結(jié)果表明海藻糖的抗冷凍效果優(yōu)于蔗糖和山梨醇混合物。然而，目前關(guān)于海藻糖和甘露醇復(fù)配對反復(fù)凍融引起的肌原纖維蛋白氧化變性的影響還鮮有報道。

在眾多肉類食品中，蝦蛄（Oratosquilla oratoria）作為一種營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美的海產(chǎn)品，深受消費者喜愛。蝦蛄收獲的季節(jié)性非常強，為便于保鮮，常采用低溫貯存。在貯藏加工過程中，蝦蛄肉品質(zhì)的變化直接影響其消費價值，其中肌原纖維蛋白對蝦蛄產(chǎn)品的保水性、質(zhì)地等品質(zhì)都起著決定性作用。因此，本實驗以蝦蛄為對象，研究反復(fù)凍融處理對肌原纖維蛋白氧化、結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，探索凍融循環(huán)對蝦蛄蛋白品質(zhì)的影響規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，探討4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇抗凍劑對蝦蛄肌原纖維蛋白的冷凍保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用口蝦蛄捕自渤海灣（天津）近海海域，購于天津市北辰區(qū)老板娘水產(chǎn)城。

海藻糖、甘露醇、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純 上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-E高效冷凍離心機 美國Beckman公司；U5100紫外-可見分光光度計、F-4600熒光分光光度儀、SU3500掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Physica MCR301高級旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利Anton Paar公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；POLYTRON PT 2100勻漿機 瑞士Kinematica公司。

1.3 方法

1.3.1 凍融循環(huán)處理

蝦蛄去頭、尾，剝殼，取肉剁碎。將蝦蛄肉糜分為兩份，每份1 000 g，一份為對照組，一份為實驗組。將實驗組肉糜浸泡在冷凍保護劑溶液中2 h，然后將瀝干的肉糜樣品（約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）放入聚乙烯自封袋中（5 份，每份200 g，分別編號為實驗1、2、3、4、5組）。對照組做同樣的分組處理。將對照組和實驗組樣品置于－20 ℃冰箱中冷凍，5 d后取出，室溫解凍至其中心溫度為0 ℃，然后放回－20 ℃冰箱中貯藏，此為一個凍融處理。從5 組樣品中隨機抽取3 份進行各項指標(biāo)的測定，然后將剩余樣品放回－20 ℃繼續(xù)冷凍5 d。依此方法分別進行0、1、3、5 次凍融處理，并進行相應(yīng)的指標(biāo)測定。考慮到目前工業(yè)上采用的商業(yè)抗凍劑為4%蔗糖＋4%山梨糖醇，因此本實驗選擇4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇為冷凍保護劑溶液。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

參考Park等[5]的方法。向肉糜中加入4 倍體積蛋白提取液（0.1 mol/L NaCl、0.002 mol/L MgCl2、0.001 mol/L EDTA-2Na、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0），11 000 r/min勻漿25 s，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，棄上清液，留沉淀，再加入蛋白提取液重復(fù)上述操作2 次得粗蛋白。將所得粗蛋白與4 倍體積0.1 mol/L NaCl溶液混合，勻漿25 s，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，棄上清液，留沉淀，再加入NaCl溶液重復(fù)上述操作2 次即得蝦蛄肌原纖維蛋白。采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 凍融循環(huán)對蝦蛄肌原纖維蛋白氧化及結(jié)構(gòu)的影響

1.3.3.1 羰基含量測定

采用DNPH法測定蛋白羰基含量[6]。取0.5 mL蛋白溶液（5 mg/mL）于離心管中，加入1 mL 10 mmol/L DNPH（溶于2 mol/L鹽酸），室溫避光反應(yīng)1 h，每隔10 min渦旋一次，然后加入等體積20%三氯乙酸溶液，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，所得沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）充分洗滌3 次，以除去未反應(yīng)的DNPH。加入4 mL鹽酸胍溶液（6 mol/L，溶于20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.5），37 ℃溶解沉淀20 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液于370 nm波長比色。羰基含量根據(jù)摩爾消光系數(shù)22 000 L/（mol?cm）計算。空白對照組加入1 mL 2 mol/L鹽酸（不含DNPH），其余步驟同上。

1.3.3.2 總巰基含量測定

蛋白巰基含量通過DTNB法測定[7]。肌原纖維蛋白（5 mg/mL）溶解于含5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的Tris緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.0），80 ℃水浴45 min，8 000 r/min離心10 min。收集上清液用于巰基含量的測定。用相同緩沖液配制10 mmol/L DTNB。取0.5 mL上清液與2 mL 5% SDS/Tris緩沖液混合，隨后加入0.2 mL DTNB避光反應(yīng)30 min，混合液于波長412 nm測定吸光度。空白以5% SDS/Tris緩沖液替代蛋白樣品。采用摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol?cm）計算總巰基含量。

1.3.3.3 表面疏水性測定

參考Chelh等[8]的方法。向1 mL肌原纖維蛋白分散液（5 mg/mL）中加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍（bromophenol blue，BPB）（去離子水溶解）。空白組用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）替代。室溫下充分振蕩10 min，5 000 r/min離心15 min。取上清液稀釋10 倍后在595 nm波長處測吸光度A。疏水性用BPB結(jié)合量表示，計算如式（1）所示：

1.3.3.4 內(nèi)源性色氨酸熒光強度測定

色氨酸熒光強度的變化通過F-4600熒光分光光度儀進行檢測。用0.5 mol/L NaCl溶液將蛋白稀釋為質(zhì)量濃度0.04 mg/mL，室溫條件下于295 nm波長處激發(fā)，記錄下310～400 nm波長處發(fā)射光譜供后續(xù)分析。扣除溶劑發(fā)射光譜（在相同條件下獲得）以排除干擾。

1.3.4 凍融循環(huán)對蝦蛄肌原纖維蛋白凝膠性能的影響

1.3.4.1 動態(tài)流變測試

根據(jù)Li Chunqiang等[9]的方法。將20 mg/mL蛋白樣品（分散于0.5 mol/L NaCl）置于離心管內(nèi)，于4 ℃離心1 min脫氣。將脫氣后的蛋白均勻涂布于流變儀的下平板上，將上平板降至1 mm時用柔軟的實驗用紙輕輕擦去周圍多余的樣品，并在邊緣涂上硅油以防加熱過程中水分流失。在振蕩模式下以1 ℃/min的升溫速率加熱樣品，記錄20～80 ℃的升溫曲線。設(shè)置振蕩頻率為0.1 Hz，控制最大應(yīng)力為0.02。凝膠性能通過儲存模量（G’）進行評價。

1.3.4.2 凝膠強度及持水力測定

將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為40 mg/mL，取20 mL于平底玻璃瓶中，加蓋密封，水浴加熱。具體升溫程序如下：起始溫度20 ℃，以1 ℃/min線性升溫至73 ℃。加熱結(jié)束后，立即將樣品放入冰水混合物中冷卻30 min，然后置于4 ℃冰箱過夜。在測定凝膠性能之前，將凝膠樣品從4 ℃取出放在室溫下平衡2 h。利用質(zhì)構(gòu)儀測定凝膠強度，選用P0.5圓柱探頭，測試全過程設(shè)定探頭速率均為1 mm/s，凝膠強度定義為破壞凝膠結(jié)構(gòu)需要的初始力。

凝膠持水力通過離心的方法測定。將一定質(zhì)量凝膠于4 ℃、6 000 r/min離心15 min，記錄離心管（m）以及離心前后的總質(zhì)量分別為m1和m2。持水力的計算如式（2）所示：

1.3.4.3 掃描電子顯微鏡觀測凝膠微觀結(jié)構(gòu)

用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制2.5%戊二醛溶液固定凝膠樣品12 h，從而獲得樣品塊（3 mm×3 mm×3 mm）。然后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌3 次，在30%、50%、70%、90%、95%和100%乙醇溶液中梯度脫水。最后將樣品冷凍干燥后即可進行電子顯微鏡掃描。

1.3.5 凍融循環(huán)對蝦蛄肌原纖維蛋白乳化特性的影響

將8 mL 1 mg/mL的蛋白溶液與2.0 mL大豆油混合，15 000 r/min勻漿1 min，分別在第0、10分鐘時在距離心管底部0.5 cm處取100 μL勻漿液，加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，混勻，以0.1% SDS為空白，500 nm波長處測定吸光度。蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性由式（3）、（4）計算：

式中：A500nm為500 nm波長處的吸光度；n為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；φ為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)/%；A0和A10分別為第0、10分鐘時500 nm波長處吸光度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 凍融循環(huán)對蝦蛄肌原纖維蛋白氧化及結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 蛋白羰基

蛋白羰基側(cè)鏈含—NH—或—NH2的氨基酸非常容易受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的氧化攻擊而轉(zhuǎn)化為羰基。因此，蛋白羰基含量的變化是目前最為廣泛用于衡量蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)。蛋白羰基產(chǎn)生途徑主要包括：氨基酸側(cè)鏈的氧化、肽鍵的斷裂、外源性羰基的引入（脂肪氧化產(chǎn)物中的醛類以及酚類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物半醌或醌類共價鏈接到蛋白側(cè)鏈）。一般來說，羰基含量越高表明蛋白氧化程度越高。經(jīng)不同凍融次數(shù)處理后的蝦蛄肌原纖維蛋白羰基含量的變化如圖1所示。未經(jīng)凍融處理的對照組和實驗組的蛋白羰基含量無差異，這說明冷凍保護劑海藻糖和甘露醇對肌原纖維蛋白羰基含量沒有影響。在進行1、3、5 次凍融處理后，蛋白發(fā)生不同程度的氧化變性，表現(xiàn)為羰基含量顯著上升，尤其在反復(fù)凍融5 次后較未經(jīng)凍融的蛋白羰基含量增加了47.4%（P＜0.05）。這與姜晴晴等[2]的研究結(jié)果一致。海藻糖和甘露醇的添加有效抑制了氧化誘導(dǎo)的羰基含量上升：其抑制效率在5.2%～14.4%之間。在冷凍過程中，蝦蛄肉中的水分部分凍結(jié)導(dǎo)致細胞內(nèi)外溶質(zhì)濃度增加，同時，冰晶生長的物理效應(yīng)會破壞肌肉細胞，導(dǎo)致線粒體和溶酶體酶等滲入肌漿中，從而加速蛋白、脂肪的氧化反應(yīng)[10]。冷凍保護劑如蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇等可以降低肉品的冰點[11]，而且，海藻糖和甘露醇等可以與蛋白質(zhì)分子的功能基團通過氫鍵或離子鍵相結(jié)合，這樣每個蛋白質(zhì)分子都被冷凍保護劑分子所包覆，降低了因反復(fù)凍融引發(fā)的凍結(jié)和氧化傷害[12]。

圖1 凍融處理對肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effects of freeze-thaw cycles on carbonyl content of myofibrillar protein

2.1.2 總巰基含量

肌原纖維蛋白主要由肌球蛋白和肌動蛋白組成，肌球蛋白約占其總量的43%，每分子含有40 個巰基，不含二硫鍵；肌動蛋白約占22%，每分子含有5 個巰基，也不含二硫鍵。巰基易受自由基攻擊而轉(zhuǎn)化成二硫鍵。因此，巰基含量的減少以及二硫鍵的形成是蛋白氧化的重要前期指標(biāo)之一。由圖2可知，凍融處理對肌原纖維蛋白巰基含量的影響與羰基變化趨勢恰好相反。未經(jīng)凍融處理的蛋白總巰基含量約為（44.26±0.74）nmol/mg，凍融處理1、3、5 次后，巰基含量分別下降了12.7%、17.7%、37.6%。這與Benjskul等[13]在大西洋白鱈冰藏過程中得到的研究結(jié)果相似。反觀實驗組，經(jīng)1、3、5 次凍融處理后，蛋白巰基含量分別下降了6.2%、9.6%、25.5%，4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇顯著抑制了蛋白巰基含量的減少。在凍藏過程中肌原纖維蛋白巰基含量的下降可能是由于水形成冰結(jié)晶后，破壞肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使巰基暴露出來，進而被氧化成二硫鍵使巰基含量下降。Hamre等[14]同樣發(fā)現(xiàn)，大眼海魚在－18 ℃冷藏時總巰基含量隨冷藏時間延長而下降，而二硫鍵含量卻上升。海藻糖和甘露醇等冷凍保護劑作為蛋白質(zhì)分子的防護屏障，能阻止肌肉中各種促氧化成分如自由基等對蛋白分子的攻擊，從而有效抑制蛋白巰基向二硫鍵的氧化轉(zhuǎn)化[15]。Li Yanqing等[16]研究發(fā)現(xiàn)蔗糖和山梨糖醇對凍藏6 個月后的魚糜蛋白總巰基含量也有顯著的保護作用。Zhou Aimei[17]和Etemadian[18]等也得到了類似的結(jié)論。

圖2 凍融處理對肌原纖維蛋白總巰基含量的影響Fig. 2 Effects of freeze-thaw cycles on total sulfhydryl content of myofibrillar protein

2.1.3 表面疏水性

BPB可以結(jié)合于蛋白質(zhì)分子表面的疏水性位點，因此蛋白質(zhì)所能結(jié)合的BPB量可被用作反應(yīng)蛋白表面疏水性的指標(biāo)[8]。一般來說，表面疏水性增加是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開的一個重要指標(biāo)。氧化導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的疏水性氨基酸殘基使得蛋白表面疏水性增強。如圖3所示，與未經(jīng)凍融處理的蛋白樣品相比，經(jīng)1、3、5 次凍融處理的蛋白所結(jié)合的BPB量明顯上升，尤其是在5 次凍融循環(huán)后表面疏水性增加了1.48 倍，說明反復(fù)凍融導(dǎo)致肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)展開、疏水性上升。這可能是因為凍融處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化程度加深，表現(xiàn)為蛋白羰基化、肽主鏈的斷裂以及分子間二硫鍵的形成，蛋白質(zhì)解折疊，一些疏水性的脂肪族與芳香族氨基酸側(cè)鏈基團從蛋白分子內(nèi)部暴露，從而引起表面疏水性的增加[2,19]。海藻糖和甘露醇的添加對蛋白表面疏水性上升具有顯著的抑制作用，抑制率分別為10.7%（1 次凍融）、23.2%（3 次凍融）、19.6%（5 次凍融）。Herrera等[20]研究表明冷凍保護劑能減少非極性氨基酸側(cè)鏈基團的暴露，從而降低蛋白的表面疏水殘基數(shù)量，阻止蛋白分子因疏水相互作用引發(fā)的過度聚集。

圖3 凍融處理對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig. 3 Effects of freeze-thaw cycles on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.1.4 內(nèi)源色氨酸熒光

蛋白質(zhì)內(nèi)源性色氨酸熒光對于其周邊微環(huán)境的極性非常敏感。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于折疊狀態(tài)時，色氨酸殘基主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)核這樣的疏水環(huán)境中，此時被激發(fā)的色氨酸具有相對較高的熒光強度；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)部分或者完全展開時，色氨酸殘基就會更多的暴露于蛋白質(zhì)分子表面，此時被激發(fā)的色氨酸熒光強度降低。因此，內(nèi)源性色氨酸熒光特性常被用于蛋白三級結(jié)構(gòu)的檢測[21]。如圖4所示，隨著凍融處理次數(shù)的增加，肌原纖維蛋白的熒光強度顯著下降，這表明蛋白三級結(jié)構(gòu)的展開。反復(fù)凍融破壞了肌原纖維蛋白天然的排列方式，蛋白展開變性使得原本位于內(nèi)部的色氨酸殘基暴露于表面而處于溶劑的極性環(huán)境中，從而引起內(nèi)源熒光強度下降。添加海藻糖和甘露醇使熒光強度有不同程度回升，說明在二者的保護作用下，蛋白分子變性程度較低，結(jié)構(gòu)變化相對較小，色氨酸殘基暴露少，這與上述表面疏水性結(jié)果相吻合。

圖4 凍融處理對肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光強度的影響Fig. 4 Effects of freeze-thaw cycles on tryptophan fl uorescence intensity of myofibrillar protein

2.2 凍融處理對蝦蛄肌原纖維蛋白凝膠性能的影響

2.2.1 動態(tài)流變特性

圖5 凍融循環(huán)對肌原纖維蛋白在熱凝膠過程中彈性G’的影響Fig. 5 Effects of freeze-thaw cycles on storage modulus (G’) of myo fi brillar protein during thermal gelation

如圖5所示，未經(jīng)凍融的蛋白在加熱過程中出現(xiàn)兩個典型的流變轉(zhuǎn)變峰，其峰值分別在44 ℃和50 ℃左右，第1個峰的出現(xiàn)可歸因于肌球蛋白頭部變性及交聯(lián)，第2個峰應(yīng)是肌球蛋白尾部解旋并聚集的結(jié)果。在加熱早期階段，肌球蛋白的聚集主要是涉及二硫鍵交換的頭部-頭部結(jié)合，在隨后的加熱過程中是部分不可逆的尾部解螺旋及尾部-尾部交聯(lián)，緊接著就是三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[22]。

經(jīng)1、3、5 次凍融循環(huán)后，肌原纖維蛋白G′在第1個峰值處急劇下降，較未凍融蛋白分別下降了14.6%、70.4%、86.7%，且最終G′值也隨著凍融次數(shù)的增加而顯著下降，這說明3 次及以上凍融循環(huán)嚴(yán)重破壞了肌原纖維蛋白的凝膠性能。此外，經(jīng)凍融處理的蛋白G′的起始上升溫度與轉(zhuǎn)變峰的溫度較未凍融蛋白均有所提前，可能由于反復(fù)凍融破壞了蛋白結(jié)構(gòu)，使得埋藏于蛋白分子內(nèi)部的活性官能團暴露出來，從而加強了蛋白之間的相互作用[23]。海藻糖和甘露醇的添加顯著提高了蛋白在加熱過程中的G′，尤其在3、5 次凍融循環(huán)后，第1個轉(zhuǎn)變峰值較對照組分別提高了1 倍和2.8 倍。反復(fù)凍融導(dǎo)致肌原纖維蛋白變性，結(jié)構(gòu)過度展開，蛋白聚集沉淀，活性功能基團被屏蔽，從而破壞蛋白凝膠性能。海藻糖和甘露醇等冷凍保護劑能與蛋白在連續(xù)相中相互作用，從而產(chǎn)生具有黏彈性的非晶態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[24]。Li Xingke等[25]的研究得到與本實驗類似的結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)殼聚糖對鰱魚鹽溶蛋白的凝膠性能同樣有促進作用。

2.2.2 凝膠強度及持水力

圖6 凍融循環(huán)對肌原纖維蛋白凝膠強度（A）和持水力（B）的影響Fig. 6 Effects of freeze-thaw cycles on gel strength (A) and waterholding capacity (B) of myofibrillar protein

如圖6所示，蝦蛄肌原纖維蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠強度隨著凍融次數(shù)的增加顯著下降（P＜0.05），蛋白經(jīng)1、3、5 次凍融循環(huán)處理后其凝膠強度較未凍融蛋白分別下降了20.2%、39.7%、56.4%。Erikson等[26]也發(fā)現(xiàn)凍藏會顯著降低三文魚里脊肌原纖維蛋白的凝膠硬度。4 g/100 mL海藻糖＋4 g/100 mL甘露醇則可以有效抑制蛋白凝膠強度的下降，抑制效率在11.2%～33.6%之間。凍融循環(huán)導(dǎo)致蝦蛄肌球蛋白和肌動球蛋白變性，以致于在隨后的熱處理過程中無法形成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[27]，因此得到較低的凝膠強度。海藻糖和甘露醇的加入抑制了蛋白氧化和變性，降低蛋白聚集程度，Kong Baohua等[15]也證實了這一點。冷凍保護劑與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后，使得肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的自由水被捕獲，有效阻止蛋白冷凍變性[27]。因此海藻糖和甘露醇可以提高蝦蛄蛋白的成膠能力，這與動態(tài)流變結(jié)果一致。

凝膠持水力指凝膠保持自身水分或補充水分的能力，與凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的粗糙程度有關(guān)。蝦蛄肌原纖維蛋白凝膠持水力的變化趨勢與凝膠強度一致。肌球蛋白組分對凝膠的形成起關(guān)鍵作用[28]。樣品中肌球蛋白參與凝膠的程度隨著蝦蛄凍融次數(shù)的增加而降低，因此持水力也隨之下降。海藻糖和甘露醇的添加有利于凝膠持水力的提升，相較于對照組分別提高了7.1%（1 次凍融）、18.7%（3 次凍融）、29.0%（5 次凍融）。海藻糖和甘露醇等冷凍保護劑一方面可以通過氫鍵作用結(jié)合自由水，固定肉糜中的水分；另一方面也可以減少水分子在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的位移，從而提高持水力[27]。

2.2.3 凝膠微觀結(jié)構(gòu)

圖7 凍融循環(huán)對肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 7 Effects of freeze-thaw cycles on microstructure of myofibrillar protein gels

通過分析動態(tài)流變、凝膠強度與持水力結(jié)果，本實驗選取未經(jīng)凍融和經(jīng)3、5 次凍融處理的蛋白進行凝膠微觀結(jié)構(gòu)表征。如圖7所示，對照組和實驗組的未凍融蛋白的熱制凝膠結(jié)構(gòu)致密，表面較為平整，孔隙分布均勻。經(jīng)3、5 次凍融處理后（放大掃描電子顯微鏡觀察倍數(shù)），蛋白凝膠結(jié)構(gòu)劣變且程度逐漸加深，產(chǎn)生大量不規(guī)則的聚集體，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不明顯，說明肌原纖維蛋白在反復(fù)凍融過程中發(fā)生聚集，這與動態(tài)流變、凝膠強度與持水力的結(jié)果一致。添加海藻糖和甘露醇顯著改善了蛋白的凝膠結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為促使不規(guī)則的聚集體參與凝膠而形成多孔且孔徑均一有序的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對應(yīng)提高的凝膠強度及持水力。

2.3 凍融處理對蝦蛄肌原纖維蛋白乳化特性的影響

圖8 凍融循環(huán)對肌原纖維蛋白乳化活性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）的影響Fig. 8 Effects of freeze-thaw cycles on emulsifying properties of myofibrillar protein

如圖8所示，隨著凍融次數(shù)的增加，肌原纖維蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性都顯著下降（P＜0.05），其中凍融處理5 次后乳化活性和乳化穩(wěn)定性下降了31.6%，這與Xia Xiufang等[29]在豬肉中的研究結(jié)果一致。此結(jié)果表明，反復(fù)凍融破壞了肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致蛋白與脂肪交聯(lián)的能力下降，從而使其乳化活性及乳化穩(wěn)定性下降。添加海藻糖和甘露醇后，蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均有不同程度回升。蛋白的乳化性受眾多因素影響，其中蛋白變性是導(dǎo)致乳化能力下降的主要原因，氧化變性會限制蛋白在油滴表面吸附的靈活性[27]。此外，Srikar等[30]研究表明脂肪和游離脂肪酸的氧化產(chǎn)物也會降低蛋白的溶解性和乳化能力。結(jié)合研究結(jié)果和相關(guān)文獻[15]，冷凍保護劑能顯著抑制蛋白羰基化和脂質(zhì)氧化，防止蛋白變性，從而起到穩(wěn)定乳狀液的作用。

糖醇類物質(zhì)的抗凍作用機理是分子中的羥基與蛋白質(zhì)分子的某些功能基團結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子處于飽和狀態(tài)，從而避免蛋白質(zhì)分子之間的聚集變性。同時，糖醇類物質(zhì)的游離羥基還能有效地束縛水分子，從而降低“共晶點”溫度，減少冰晶體的形成量，形成一個不完全凍結(jié)區(qū)域，隔離和減緩蛋白質(zhì)分子的聚集，進而防止蛋白質(zhì)的凝聚變性。一般，糖醇類物質(zhì)的添加量與防止蛋白質(zhì)冷凍變性的效果呈正比[31]。

3 結(jié) 論

本實驗研究海藻糖和甘露醇對反復(fù)凍融引起的蝦蛄肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性變化的影響。結(jié)果顯示經(jīng)過反復(fù)凍融處理，肌肉結(jié)構(gòu)完整性破壞，蛋白氧化變性，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)羰基含量和表面疏水性增加，總巰基含量和色氨酸熒光強度顯著下降，同時蛋白的功能性質(zhì)（凝膠和乳化特性）下降，影響其食用及加工利用品質(zhì)。而海藻糖和甘露醇的添加能有效抑制蛋白的變性程度，減少蛋白結(jié)構(gòu)的變化，顯著提高蛋白在熱凝膠過程中的G’，改善蛋白的凝膠特性（凝膠強度、持水力和三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)）、乳化活性和乳化穩(wěn)定性。海藻糖和甘露醇作為食品添加劑添加到低溫肉制品中，可改善肉品的膠著性、持水性和柔嫩性，減少營養(yǎng)損失，提高產(chǎn)品質(zhì)量，具有廣闊的應(yīng)用前景。