基于無機元素的花椒產地溯源和品種聚類分析

吳 振，李 紅，楊 勇,3，譚紅軍，詹 永,*，賈鳳霞，李孝彬，王福強

（1.重慶市中藥研究院，中藥健康學重慶市重點實驗室，重慶 400065；2.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121；3.重慶市中藥大健康工程技術研究中心，重慶 400065；4.四川省廣元市旺蒼縣農業局，四川 廣元 628200）

花椒屬（Zanthoxylum）植物屬蕓香科灌木，小喬木或木質藤本，全世界約有250 種，我國約有39 種和14 變種；主要包括紅花椒（Z. bungeanum Maxim.）和青花椒（Z. schinifolium Sieb. et Zucc.）[1-3]。花椒屬植物的干、枝、葉、果皮均具有食用和藥用功效，其中花椒果皮（以下統稱花椒）可作為調味品、香辛料、木本油料或入藥，以其良好的生理活性受到人們的廣泛關注和研究[4-8]。花椒營養成分豐富，主要有揮發油類、黃酮類、生物堿（主要為喹啉類和異喹啉類）、鏈狀不飽和脂肪酸酰胺類（即麻味物質）、不飽和脂肪酸、花椒香豆素、芳樟醇、乙酸芳樟酯、D-檸檬烯等[9-15]；研究表明，花椒提取物具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、鎮痛、減肥、降血脂、增強機體免疫力等功效[16-18]。

花椒所含無機元素的研究也備受關注，不同產地和品種花椒中活性成分差異較大，無機元素含量不僅受花椒遺傳特性的控制，而且與不同栽培地區的環境因素及栽培條件等因素有關[10]。研究和分析花椒無機元素的種類及其含量，對人體的營養健康和攝入安全有至關重要的作用，有利于評價花椒的營養價值，了解其被污染的情況和程度，以便查清和控制污染源[19]；同時探尋能表征花椒地域信息的特異性指標，有利于產地保護和溯源。無機元素的含量差異能反映花椒的品質及其產地特征，結合數據統計學方法對其進行分析比較，對花椒品質評價、產地判別和“產品確證”具有重要意義。紅花椒主要產地為陜西韓城、山東泰安、四川漢源、茂汶和會陽、甘肅武都、河北涉縣等，青花椒主產地云南昭通、貴州關嶺、四川金陽、四川漢源、重慶江津等，不同地區的氣候、水質、種植條件、施肥方法以及土壤類型均存在較大差異。目前，無機元素分析結合化學計量學方法已經廣泛應用于水果、蜂蜜、茶葉、葡萄酒產地溯源的研究與應用[20-25]。基于此，本實驗采用電感耦合等離子體原子發射光譜（inductively coupled plasmaatomic emission spectrometry，ICP-AES）法測定不同產地和品種花椒中Al、B、Ba、Ca、Cd、Co、Cu、Na、K、Fe、Mg、Mn、Zn、Ni、Pb、As、Se、Hg、Cr、V、Sr 21 種無機元素的含量，對國內主要產地的紅花椒和青花椒資源的無機元素組成數據應用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLSDA），為花椒資源的營養價值評價、污染狀況、產地識別與保護、創新與利用等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試花椒材料為全國6 個省份搜集的花椒種質80 份。紅花椒產地：陜西韓城（n=11）、四川漢源（n=7）、四川茂汶（n=7）、甘肅武都（n=7）。青花椒主產地：云南昭通（n=11）、貴州關嶺（n=8）、四川金陽（n=10）、四川漢源（n=8）、重慶江津（n=11）。

Al、B、Ba、Ca、Cd、Co、Cu、Na、K、Fe、Mg、Mn、Zn、Ni、Pb、As、Se、Hg、Cr、V和Sr標準儲備液（100 mg/L） 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸、過氧化氫均為優級純，其他化學試劑均為國產分析純。所用溶液均利用蒸餾水自行配制；所用玻璃器皿均用1%硝酸浸泡24 h，以便除去雜質等因素干擾，然后用去離子水沖洗2～3 次，烘干備用。

1.2 儀器與設備

Optima 7000DV型全譜直讀ICP-AES儀 美國Perkin Elmer公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒濕法消化

花椒樣品采集后去除雜質，置陰涼通風處自然風干，再置于50 ℃干燥箱中烘干至恒定質量，粉碎后過60 目篩，置于干燥器中備用。將樣品（5.00 g）置于潔凈的250 mL玻璃圓底燒瓶，加入一定量的HNO3-HClO4（4∶1，V/V）混酸加熱消化完全，注意及時補加混酸，當溶液變為清亮無色并伴有白煙時，繼續加熱至近干，再向三角瓶中加入少量超純水繼續加熱以去除多余的高氯酸，蒸發至近干，冷至室溫，加濃HNO310 mL及適量水溶解消化產物并定容于50 mL容量瓶中成為供試液。每個樣品分別濕法消解3 次，測定結果取平均值。

1.3.2 ICP-AES測定條件

參考姚鑫等[26]的方法。儀器參數：射頻功率1 350 W；檢測器CID低波段（＜265 nm），積分時間15 s；高波段（＞265 nm），積分時間5 s；進樣霧化器氬氣壓力28 psi；進樣蠕動泵轉速100 r/min；輔助氣流量1.0 L/min，載氣流速1.12 L/min；測定波長范圍188.979～396.153 nm。

1.3.3 花椒無機元素的測定

按1.3.2節所述ICP-MS儀器工作條件，測定質量濃度分別為10、20、40、80、100 μg/L的標準溶液中各元素含量，得到標準曲線回歸方程。然后按1.3.1節方法消解花椒樣品，測定、計算樣品中各無機元素含量。

1.3.4 PCA和PLS-DA方法

由于花椒各元素指標在量綱和數量級上存在較大差異，為降低量綱和數量級對分析結果的影響偏差，PCA和PLS-DA均采用經過標準化處理的數據。標準化公式如下：

式中：Xij為第i單位的第j指標值經過標準化處理后的數據；Yij為第i單位的第j指標值；j和Sj分別為第j指標數據的平均值和標準差。

顯著性分析采用SAS 8.2（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）的最小顯著性差異法，P＜0.05，差異顯著。采用SIMCA-P 13.0（Umetrics，Umea，Sweden）進行PCA和PLS-DA多變量數據組的相似性或相異性，分別測定3 次，根據不同產地與無機元素相關數據矩陣計算其特征值和貢獻率。

2 結果與分析

2.1 精密度、重復性和加樣回收率結果

各無機元素的精密度、重復性分別在0.48%～2.36%和1.25%～3.01%之間，相對標準偏差在1.87%～3.45%之間，加樣回收率在95.7%～106.3%之間，說明該方法良好。

2.2 花椒中21 種無機元素含量的測定分析

如表1所示，比較不同產地花椒中無機元素的含量，發現Al、Ca、Na、K、Fe、Mg、Mn等元素含量較高，其平均值分別達到154.72、297.85、323.23、814.43、25.41、363.48、38.92 μg/g，其中Al、Ca、Na、K、Fe、Mg、Mn平均含量最高的產地分別為：陜西韓城、四川漢源（青花椒）、重慶江津、陜西韓城、貴州關嶺、陜西韓城、重慶江津。測定結果表明，不同產地花椒的常量元素、微量元素和重金屬差異較大。Cd、Pb、As、Hg、Cr等重金屬均未超過GB 2762—2017《食品中污染物限量》中關于香辛料的限量要求。盡管如此，但各個產地重金屬差異仍然較大，針對目前不同產地花椒質量及污染狀態復雜情況，分析不同產地花椒共性主因子作為質量控制指標，也可有效控制不同產地花椒的污染狀況。

表1 不同產地花椒中無機元素含量（n=3）Table 1 Concentrations of inorganic elements in Zanthoxylum from different geographical origins (n= 3)μg/g

表2 不同產地花椒中無機元素的相關性矩陣Table 2 Correlation matrix of inorganic elements of Zanthoxylum from different geographical origins

2.3 花椒無機元素含量相關性分析

采用SAS 8.2軟件進行花椒各無機元素間相關性分析，如表2所示。顯著性分析發現，花椒中有諸多對元素呈顯著正相關（P＜0.05），如Ca與Fe、Se、Sr呈正相關，Cu與Al、Ba、Co、Na、Pb、As、Cr、V呈正相關，Fe與Sr呈極顯著正相關，表明這些元素間具有相互協同、促進吸收的關系，同時說明花椒在富集以上無機元素時具有較強的協同作用，但其差異與花椒品種、栽培環境等因素相關；負相關表明該對元素間具有相互拮抗的關系，如Ca與Cd、Co、Cu、Ni、Pb、Cr、V等之間；Hg與其他元素相關性較差，說明Hg元素差異可能主要源于環境土壤差異。此外，不同產地花椒的無機元素存在較大差異，可能與產地的土壤、氣候等因素相關，同時花椒品種及個體差異對無機元素的吸收和富集能力也不盡相同，但在花椒的生長過程中這些元素之間是如何相互影響的仍有待進一步研究。

2.4 PCA和PLS-DA分析花椒中21 種無機元素

2.4.1 主成分及主因子提取過程分析

表3 PCA和PLS-DA的累計貢獻率Table 3 Accumulated contribution rate of PCA and PLS-DA

如表3所示，根據特征值大于1的原則[27]，PCA主要提取了5 個主成分，其特征值分別為8.738、4.956、2.661、1.304、1.008，各個主成分的方差貢獻率分別為41.60%、23.60%、12.67%、6.21%、4.80%，累計貢獻率高達88.88%；PLS-DA提取了6 個主因子，其特征值分別為134.034、57.759、16.178、3.298、2.083、1.456，各個主因子的方差貢獻率分別為62.10%、26.76%、7.50%、1.53%、0.97%、0.68%，累計貢獻率高達99.54%；其中PCA和PLS-DA的前3 個主成分和主因子分別反映了原始數據提供信息總量的77.87%和96.36%。因此可以將PLS-DA的前3 個主因子作為評價所采集的80 份花椒樣品質量的綜合變量，達到了對評價不同產地花椒無機元素含量指標的降維目的。

提取了PCA初始因子載荷矩陣，根據各無機元素在前3 個主要主成分上的載荷，可確定Al、B、Cd、Cu、Mn、Ni、Se、Cr為花椒的特征元素。

2.4.2 基于PCA和PLS-DA的花椒產地及其品種的分類分析

經PCA和PLS-DA得到各花椒樣品的PC1、PC2和PC3得分值（或主因子得分值），分別以PC1為X軸、PC2為Y軸（或以PC1為X軸、PC3為Y軸），將80 個花椒樣品點分別標入二維坐標系中，即得到各主成分（或主因子）得分的二維圖，見圖1。由圖1A可知，PC1-PC2散點圖可得到樣品的分類，80 個不同產地的花椒聚為9 類，以PC1-PC2為指標的分類結果與采樣數據的分類結果基本一致；盡管如此，以PC1-PC3散點圖未能將花椒樣品有效區分（圖1B）。由圖1C、D可知，PLS-DA的散點圖均可將80 個不同產地的花椒聚為9 類；PLS-DA模型表明：紅花椒品種均聚于散點圖的右側，而青花椒品種均聚于左側。因此，花椒無機元素含量結合PLS-DA模型分析可以有效的將不同產地和品種的花椒樣品區分。研究無機元素對花椒品種和產地的影響，為花椒的品種選擇、生產加工提供理論依據。

圖1 基于PCA（A、B）和PLS-DA（C、D）的不同產地花椒樣品分布散點圖Fig. 1 Scattering plots of PCA (A, B) and PLS-DA (C, D) for geographical origins of Zanthoxylum

圖2 PCA（A）和PLS-DA（B）的花椒無機元素載荷圖Fig. 2 Loading plots of PCA (A) and PLS-DA (B) for inorganic elements of Zanthoxylum

如圖2所示，原始變量點在單個向量上的投影，與對應變量在主成分或主因子上的差異量相關，余弦值為負時，向量負相關；余弦值的絕對值大小反映兩向量間的相關性大小，值越大表明2 個向量對應的屬性之間相關性越高[28]。圖2中各花椒無機元素向量長短（即分別在主成分或主因子的載荷）代表其能解釋原始變量的程度（即差異貢獻），其方向表示與主成分（或主因子）的相關性；圖2中2 個不同花椒無機元素向量夾角小于90°代表其呈正相關；當2 個向量近似垂直時，2 個屬性之間相關性很弱，幾乎互不影響；不同花椒無機元素向量方向相反代表其間存在負相關；如圖2B所示，Ni和B向量幾乎重合（之間夾角較小），表明其存在很強的相關性，這與表2的分析一致。王帥等[29]研究了九葉青花椒葉片礦質營養元素主要物候期動態變化規律，為花椒樹體的營養診斷和科學施肥提供依據；鄭雅楠[30]研究發現，Al、Fe、V、K、Zn、Pb為陜西花椒的特征元素，但對無機元素聚類分析不能區分花椒的產區；國內外研究均認為決定植物性資源元素含量和分布特征的根本因素是其產地環境和品種[31-33]。PCA與PLS-DA均為經典的多元統計分析方法，通過數學多維模型進行降維和排除干擾處理，從而直觀地發現花椒無機元素組別之間的差異。通過結合并對比花椒無機元素的PCA與PLS-DA模型，可以篩選花椒的特征元素，揭示產地環境和品種對花椒品質和產地保護的影響，并建立花椒資源的產地與品種的判別和質量評價模型。

3 結 論

采用ICP-AES可以有效分析花椒中21 個無機元素（Al、B、Ba、Ca、Cd、Co、Cu、Na、K、Fe、Mg、Mn、Zn、Ni、Pb、As、Se、Hg、Cr、V、Sr），可評價各產地紅花椒和青花椒的元素含量、污染狀態及其綜合品質。所構建的花椒整體無機元素的指紋圖譜及其PLS-DA方法，克服了由單個或幾個成分作為評價指標研究花椒產地及其品質的缺陷。本研究通過PCA和PLS-DA進行花椒產地與其無機元素含量之間的相關性研究，確定Al、B、Cd、Cu、Mn、Ni、Se、Cr為花椒的特征元素；由PCA和PLS-DA篩選出的主成分或主因子，可以明顯地區分各產地的花椒，并且PLS-DA模型可以將紅花椒和青花椒區分；同時可以根據各無機元素與所提取的主成分或主因子之間的關系，對各產地及品種的花椒進行溯源。