高效液相色譜-氣相色譜聯用法測定稻谷和大米中的飽和烴礦物油

劉玲玲，李冰寧，歐陽杰，武彥文,*

（1.北京市科學技術研究院，北京市理化分析測試中心，北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京 100094；2.北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083）

礦物油是C10～C50的飽和烴（mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH）和芳香烴（mineral oil aromatic hydrocarbons，MOAH）的總稱[1]，其中MOSH包括直鏈、支鏈和環狀烷烴。MOSH有害人體健康。研究表明：人體的肝臟、脾臟和淋巴結等多個組織和器官均不同程度含有MOSH，特別容易蓄積C16～C35范圍的MOSH，導致慢性炎癥[2]。近年來，越來越多的研究數據顯示：食品中廣泛存在礦物油污染，主要污染來源包括環境污染[3-4]、原料采收和生產加工過程污染[5-6]以及包裝材料遷移[7-9]等。

礦物油組成復雜，包含數以萬計的化合物，其含量無法以其中一個或幾個化合物表示，而是需要測定總量。氫火焰離子化檢測器（hydrogen flame ionization detector，FID）是分析礦物油的理想檢測器，其等碳響應特性規避了缺乏礦物油標準的問題。由于氣相色譜（gas chromatography，GC）通常與FID聯用。因此，GC-FID成為常用的礦物油分析方法[10]。然而，作為通用檢測器，FID的靈敏度低、選擇性差，需要通過前處理凈化與富集目標物。離線固相萃取結合大體積進樣GC系統[11-15]是較為常用的方法。隨著儀器聯用技術的發展，高效液相色譜-氣相色譜（high performance liquid chromatography-gas chromatography，HPLC-GC）聯用也逐漸開始普及[16-20]，其中HPLC的作用是分離純化，通過特殊的接口技術，HPLC-GC可以同時實現凈化-轉移-富集-分析的自動化，簡化了實驗操作步驟，提高了分析效率，并且避免了實驗過程外來污染的引入[10]。

大米是世界各國的主要食糧，我國約有65%的人口日常主食是大米[21]。然而，近十幾年來礦物油污染大米的事件時有發生[1,22]。研究表明：大米中MOSH含量約為1.7～160 mg/kg[12,16,23-26]，主要來源于：1）環境污染；2）收割過程中的機械油污染；3）裝袋過程中的軟麻油污染；4）包裝材料中的印刷油墨或回收紙板的遷移污染；5）運輸和儲藏過程中的防塵劑污染；6）人為拋光大米導致的礦物油污染等[1]。針對大米的礦物油污染問題，本實驗擬通過HPLC-GC研究稻谷和大米中MOSH的含量情況，建立稻谷和大米中MOSH的定量方法，包括使用氧化鋁去除稻谷提取液中烷烴干擾物，確定HPLC自動純化MOSH的中心切割條件；應用HPLC-GC研究我國稻谷和市售大米的礦物油污染特征，分析大米中礦物油的可能污染來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻谷和大米樣品各12 個（以人工和機器兩種方式各采收6 個稻谷樣品，將機器采收的稻谷樣加工成大米樣品6 個，隨機采購市售商品大米樣品6 個）。

正己烷、二氯甲烷（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；氧化鋁（100～200 目，使用前在高溫爐中400 ℃烘烤60 h，冷卻，置于干燥器備用）國藥集團化學試劑有限公司；液體石蠟（paraffin oil，PO）、正四十八烷（n-octatetracontane，C48）、聯環己烷（cyclohexyl cyclohexane，Cycy）、膽甾烷（5-α-cholestane，Cho）、1,3,5-三叔丁基苯（1,3,5-tritert-butyl-benzene，TBB）、C7～C40正構烷烴混合標準溶液（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

自行搭建HPLC-GC聯用儀（包括LC-20A高效液相色譜系統（配備紫外檢測器）、GC-2010 plus氣相色譜儀（配備程序升溫蒸發（programmed temperature vaporizer，PTV）進樣系統、FID和AOC-5000 Plus自動進樣器） 日本島津公司；N-EVAP氮氣吹干儀 美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

C48、Cho、TBB混合標準溶液：3 mg/L；Cycy內標溶液：300 mg/L；液體石蠟標準工作溶液：0.5、1.0、5.0、25.0、50.0、100.0 mg/L。

1.3.2 樣品中MOSH的提取

稱取大米樣品10.0 g于50 mL錐形瓶中，加入10 μL 300 mg/L的Cycy內標溶液，加入正己烷于60 ℃超聲提取2 次（每次10 mL，20 min），吸取上清液；合并2 次提取液，氮吹濃縮至1 mL。為驗證提取是否完全，樣品經2 次提取后的殘渣用正己烷清洗，再加入10 mL正己烷和10 μL內標溶液于殘渣中，60 ℃超聲提取80 min，吸取上清液，濃縮后檢測其中MOSH含量，含量低于前2 次提取的4%，則認為提取完全，可以確定提取次數為2 次。

由于稻谷樣品中含有大量的天然正構烷烴，干擾后續MOSH的測定，因而提取液需先用活化的氧化鋁去除正構烷烴后再進行濃縮。具體操作方法為：將10 g活化氧化鋁裝入玻璃層析柱，以正己烷平衡柱床，然后加入提取液，以10 mL正己烷洗脫，收集洗脫液并濃縮、定容至1 mL，注入HPLC-GC分析。

1.3.3 HPLC-GC分析條件

H P L C條件：S u p e l c o L C-S I液相色譜柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）。流動相：A為正己烷，B為二氯甲烷；梯度洗脫：0～0.1 min，100% A（流速0.3 mL/min）；0.1～9.5 min，70% A（流速0.3 mL/min）；9.5～18.5 min，100% B（反向，流速0.5 mL/min）；18.5～28.5 min，100% A（流速0.5 mL/min）。進樣量：100 μL。

采用AOC-5000 Plus將MOSH餾分（2.5～3.1 min）轉移至GC的PTV汽化室，MOSH進入PTV襯管后，設置升溫程序除去溶劑，并將目標組分導入GC色譜柱中分析。PTV升溫條件：初始溫度35 ℃保持1 min（分流比180∶1），以250 ℃/min升溫至360 ℃（關閉分流閥2 min，隨后以100∶1開啟分流閥）。

G C分析條件：A g i l e n t D B-5 H T毛細管柱（15 m×0.25 mm，0.1 μm）；升溫程序：35 ℃保持4 min，以40 ℃/min升溫至370 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣；柱內采用恒壓模式，壓力為60 kPa；FID溫度380 ℃。

1.4 數據分析

以Cycy為內標物定量計算MOSH的含量。MOSH的含量通過計算譜圖基線與寬峰之間的面積得到，基線取決于樣品空白的GC譜圖；寬峰上方的尖峰為天然烷烴，定量計算時扣除[10]。

GC譜圖采集和分析分別采用5D Solution和LabSolutions軟件（日本島津公司）。數據以表示，采用GraphPad Prism 7統計軟件進行數據分析，配對t檢驗方法進行組間差異顯著性比較，P＜0.05，差異顯著，P＜0.01，差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 天然烷烴的去除

植物的角質層和表面蠟質中含有大量天然烷烴，主要為以C23～C35為主的奇數碳正構烷烴[1]。稻谷沒有去除稻殼、皮層和胚，因而含有大量天然烷烴（圖1A）。MOSH是由大量的、幾乎連續的直鏈、支鏈烷烴和環烷烴組成，其GC譜圖呈一個無法分離且跨越一定碳數范圍的寬峰，MOSH的含量只能通過對基線與寬峰之間的峰面積積分計算；而寬峰上面的尖峰為天然烷烴，不能算作污染物，計算MOSH時需要扣除。也就是說，如果天然烷烴不干擾MOSH寬峰輪廓勾勒計算峰面積，則無需去除天然烷烴[27]。然而，稻谷的GC譜圖（圖1A）顯示：以C27、C29、C31和C33為主的天然烷烴含量過多，已經嚴重干擾MOSH譜圖的積分。因此，必須通過前處理去除稻谷中的天然烷烴。

圖1 稻谷MOSH提取液經活化氧化鋁凈化前（A）、凈化后（B）的HPLC-GC譜圖Fig. 1 HPLC-GC chromatograms of crude (A) and puri fi ed (B)MOSH extracted from paddy

通常，氧化鋁有選擇性吸附長鏈正構烷烴的作用，但吸附能力不強。Fiselier等[5,28]研究表明：20 g活化氧化鋁根據不同活化溫度可吸附1～2 mg碳數高于C20的正構烷烴；同時也會吸附少量的異構烷烴和環烷烴，以及1.8～2.3 μg的液體石蠟，由于礦物油分析的復雜性與特殊性，一般認為該吸附量不影響礦物油的檢測。因此，選用400 ℃活化10 g氧化鋁凈化稻谷提取液既可以去除天然烷烴，又不影響目標物的測定。

由圖1A可見，正構烷烴含量過高，無法找到MOSH的輪廓；圖1B為去除天然烷烴后的GC譜圖。經過氧化鋁凈化，天然烷烴的C31～C35部分被完全吸附，大部分C25～C29烷烴被除去；剩余的烷烴已經不再干擾MOSH寬峰的輪廓，完全不影響礦物油寬峰面積的積分計算（圖1中方框部分）。因此，確定以10 g活化氧化鋁去除稻谷提取液中的天然烷烴。

2.2 MOSH的中心切割時間

HPLC-GC中HPLC用于分離除去樣品基質（如油脂），同時將MOSH和MOAH分離。由于HPLC色譜柱的顆粒小、分離效率高，一般采用硅膠填料即可達到分離目的[10]。其次，分離后的MOSH流分需要精準地從HPLC轉移至到GC，以完成MOSH的準確定量。本實驗通過“中心切割”技術[29]，將HPLC流出的MOSH轉移至GC分析，再結合GC的大體積進樣系統，實現凈化-轉移-富集-分析的自動化過程。

采用硅膠柱分離提取（濃縮）液中的礦物油時，MOSH最先流出，其次是MOAH，最后是樣品基質。對于MOSH餾分，根據體積排阻效應，通常高分子質量的直鏈烷烴先流出，之后為低分子質量的直鏈烷烴和環烷烴[10,30]。為精準獲得MOSH餾分，本實驗配制了C48、Cho、TBB混合標準溶液作為MOSH餾分的標記物，其中C48為高分子質量烷烴標記物、Cho為MOSH餾分終止標記物、TBB為MOAH餾分開始的標記物。精準切割MOSH餾分要求C48全部保留在MOSH中，不得出現在死體積中；Cho必須全部留在MOSH餾分中，不得出現在MOAH中；而代表MOAH的TBB則不得出現在MOSH餾分中。本實驗通過標記物確定MOSH餾分的中心切割時間為2.5～3.1 min。

2.3 方法學考察結果

2.3.1 儀器精密度和轉移性能

由于MOSH是涵蓋一定沸程范圍（C10～C50）的飽和烴混合物，低沸點物質容易在溶劑排除的過程中產生揮發損失，本實驗通過連續6 次直接進樣分析C7～C40正構烷烴混合標準溶液（1 mg/L）評估HPLC-GC的精密度和轉移性能。考察C11～C40范圍，每種正構烷烴的重復性以相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示，平均值為1.4%，儀器精密度良好。以n-C20峰面積為參照，計算C11～C40正構烷烴相對于C20的響應情況，結果如圖2所示。C11響應因子為0.76，C12響應因子為0.89，C13～C40相對于C20響應因子在0.93～0.98范圍內。因為低于C13的MOSH污染很少發生[31]，具有毒理學意義的C16～C35的響應因子在0.93～1.0范圍內，因此，HPLC-GC的轉移性能滿足食品樣品中MOSH的測定。

圖2 C11～C40相對于C20響應因子分布Fig. 2 Alkane distribution profile within the range of C11–C40

2.3.2 線性范圍

液體石蠟常用作MOSH的標準物質。將1.3.1節配制的液體石蠟系列工作溶液，在1.3.3節條件下分析。以GC譜圖中的寬峰面積與對應質量濃度繪制曲線，所得標準曲線為Y= 891 483X－216 571，相關系數為0.999 9，說明液體石蠟在0.5～100 mg/L質量濃度范圍內線性關系良好。

2.3.3 定量限的測定

定量限根據進入FID的MOSH質量濃度和體積確定。MOSH是飽和烴類化合物的集合（寬峰），其FID的檢測靈敏度僅是單個化合物（尖峰）的1%，因此，通常要求進入FID的MOSH量至少達到50 ng才能準確定量分析[10]。本實驗將10 g稻谷（或大米）的提取液濃縮至1.0 mL，注入HPLC-GC的體積為100 μL，相當于1.0 g稻谷（或大米）進入FID檢測，因此定量限為0.05 mg/kg。

2.3.4 回收率的測定

考慮到稻谷樣品經過了氧化鋁凈化，對分析結果的準確性造成影響[11]，為此，本實驗選取一個稻谷樣品進行方法準確性驗證，即向樣品中添加液體石蠟溶液進行回收率實驗，添加量分別為0.25、0.5、1.0 mg/kg[32]。分析步驟為將提取液先經氧化鋁凈化，然后濃縮、注入HPLC-GC分析，平行測定6 次后計算加標回收率和RSD。表1表明，加標回收率為89.1%～91.4%，RSD為4.6%～5.5%，說明該方法的準確度滿足分析檢測要求。

表1 稻谷樣品的加標回收率和RSDTable 1 Recoveries and RSDs for spiked samples

2.4 樣品檢測結果

表2 稻谷和大米樣品中的MOSH含量Table 2 Contents of MOSH in paddy and rice samples

任意選取江蘇省東南部如東縣的6 塊稻田，以人工和機器兩種方式采收樣品，隨后將機器采收的稻谷樣品送至當地磨坊加工成大米樣品，并且隨機采購市售商品大米樣品6 個，共收集稻谷和大米樣品24 個，采用HPLC-GC分析樣品的MOSH含量，結果見表2。本方法測定24 個稻谷和大米樣品中的MOSH，其含量為0.30～2.30 mg/kg。

2.4.1 比較人工和機器采收的稻谷樣品污染情況

人工采收的稻谷樣品（A1～A6）中MOSH含量平均值為0.50 mg/kg，污染主要來自于環境[1]。同一塊田地的水稻經機器采收（B1～B6）則MOSH含量平均上升至0.60 mg/kg，可能是采收時收割機使用的潤滑油或燃料油等機械油污染了稻谷。由表3可知，對同一田地的水稻經人工和機器兩種采收方式所得稻谷的MOSH含量配對后進行t檢驗，P=0.009 9＜0.01，進一步說明了兩種采收方式對稻谷的MOSH含量有顯著差異，機器收割方式引入了新的污染。

表3 采收方式的配對t檢驗Table 3 Paired t- test of the effect of harvesting methods on MOSH content of paddy

2.4.2 機采稻谷經磨坊加工后的污染變化

江蘇省如東縣絕大多數農民都使用當地磨坊加工的自家田地種植的大米，因此將機器采收的稻谷樣品（B1～B6）直接在當地磨坊加工成大米樣品（C1～C6）。如表4所示，機收稻谷和經過磨坊加工后大米的MOSH含量配對后進行t檢驗，P=0.001 2＜0.01，隨著稻谷脫去谷殼，磨坊大米中MOSH含量顯著降低（約50%）。由此可見，稻谷中有接近一半的礦物油污染存在于谷殼中，脫殼過程可以去除大部分礦物油污染，并且主要是毒性較大的C16～C35MOSH（表2）。

表4 磨坊加工稻谷前后的配對t檢驗Table 4 Paired t- test of the effect of mill processing on MOSH content of paddy

2.4.3 比較磨坊大米和市售大米的污染情況

我國市售商品大米樣品（7～12）MOSH的污染水平（平均值1.19 mg/kg）遠低于德國市場商品大米中MOSH的污染水平（平均值12.1 mg/kg）[24]，卻是農村磨坊大米樣品（平均值0.33 mg/kg）的4 倍。磨坊將稻谷加工成大米取樣只經過3 次碾米工序，而商品大米生產過程復雜，碾米工序后還需拋光、色選、包裝等工序，因而推斷后續的加工及包裝環節[25]給大米引入了新的污染。

2 種市售大米的MOSH譜圖（圖3）呈現出不同的碳數范圍分布和譜圖特征。其中圖3A中MOSH寬峰主要位于低沸點區域，碳數范圍以n-C17為中心，是柴油污染的典型特征；圖3B中的大部分MOSH處于中心碳為n-C29的高沸點區域，通常被認為是潤滑油的典型特征[3]。需要注意的是，這兩種污染油的污染程度不同，圖3A的柴油污染量為0.35 mg/kg，圖3B的潤滑油污染為1.81 mg/kg。由此可見，市售大米的礦物油污染很可能是在碾米之后的拋光、色選、包裝等加工環節，受到柴油和潤滑油遷移污染。

圖3 市售大米中MOSH的HPLC-GC譜圖Fig. 3 HPLC-GC chromatograms of MOSH contamination in commercial rice samples

3 結 論

本研究建立了HPLC-GC測定稻谷和大米中MOSH的方法，包括確定氧化鋁去除天然烷烴干擾的條件，應用中心切割技術精準分離得到MOSH餾分，優化了大體積進樣條件與GC分析條件，最終實現了樣品前處理與分析過程的自動化。該方法通過精密度、線性范圍、回收率等方法學考察，可以用于大米等谷物樣品的日常檢測。此外，本實驗通過比較分析稻谷和大米樣品的MOSH含量及其GC譜圖特征，推測大米的礦物油污染來源可能來自大米商品化的拋光、色選、包裝等加工環節引入的柴油和潤滑油污染，建議加強產業鏈監管，保證大米質量安全。