類雌激素農藥咪鮮胺對哺乳動物的生殖毒理研究進展

唐濤　周威　晏姣　戴清香　譚顯勝　金晨鐘　胡軍和

摘要 目前，類雌激素農藥對生態系統和人口健康造成的危害日益受到人們的關注。類雌激素農藥會影響雌性哺乳動物的內分泌系統，導致生殖和發育方面的畸形。本文就類雌激素農藥的概念及其對雌性哺乳動物的毒性作用，并著重從咪鮮胺的類雌激素作用機制、檢測方法和今后研究趨勢3個方面進行闡述，以期對于同行研究類雌激素農藥對哺乳動物生殖毒理方面的研究有一定借鑒意義。

關鍵詞 類雌激素農藥;咪鮮胺;哺乳動物;生殖毒理

中圖分類號 S481.1

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）08-0223-03

農藥是廣泛應用于害蟲和病害控制的主要化學品，僅就農業用途而言，歐盟每年使用殺蟲劑超過14萬t，大量應用殺蟲劑會引起人們對農藥危害人類健康的擔憂，如生殖安全的擔心，包括目前人類不孕發病率的逐年，上升也與之相關。為了提高農業生產效率，農藥被人們長期和大量使用”，對環境造成十分嚴重的污染，特別是有些農藥中含有類似雌激素的成分，可能影響動物甚至人的內分泌功能。

咪鮮胺是一種新型咪唑類高效廣譜殺菌劑2，通用名為Prochloraz，又叫卜菌唑、撲霉唑，具有觸殺性和內吸性，通過抑制麥角幽醇的生物合成，從而破壞菌體細胞膜功能而起作用”。研究表明，咪鮮胺在體外引發多種作用機制，因為它拮抗雄激素和雌激素受體，并抑制芳香酶活性。總之咪鮮胺是一種類雌激素農藥，其有關的干擾內分泌作用機制、檢測技術和今后研究方向方面的論述還不是很系統。因此，本文就咪鮮胺對于哺乳動物生殖毒理方面的研究予以綜述，期望對該領域今后的研究有一定的意義。

1咪鮮胺的類雌激素作用機制的研究

類雌激素農藥咪鮮胺也是一種內分泌干擾物（endocrinedisruptingchemicals，EDCs），能夠干擾正常內分泌激素生物合成4。許多EDCs具有類似雌激素活性并干擾由雌激素受體（estrogenreceptors，ER）介導的正常雌激素信號傳導作用5。EDCs可以通過與ER直接作用，間接通過芳香烴受體等轉錄因子或通過調節對正常雌激素合成和代謝至關重要的代謝酶，來調節和修飾基因組和非基因組ER的活性，從而影響雌激素的功能。雖然受體結合內源性雌激素17β一雌二二醇（Estrogen2，E2），具有相似的親和力，但許多外源性配體已顯示出對ER的選擇性間。通常，EDCs通過多種機制起作用，包括通過激活其他轉錄因子，最顯著的是芳香烴受體的間接作用，或通過雌激素代謝的修飾。具有上述類似雌激素功能，并且干擾正常內分泌功能的農藥稱之為類雌激素農藥，目前使用比較廣泛67。

某些類雌激素農藥與激素有類似的化學構象，可以和激素受體直接結合，形成配體受體復合物，復合物再結合到細胞核DNA結合域的雌激素反應元件上，誘導或抑制有關調節細胞生長和發育的靶基因的轉錄8。而某些物質可競爭性結合雄激素受體，雖然二者結合后無生理活性，但由于該類物質占據了正常激素的結合位點，使之無法與受體結合從而減弱了正常的激素效應四。咪鮮胺是羊毛甾醇14a一脫甲基酶（lanosterol14a-demethylase或CYP51A1）的抑制劑，它是從羊毛甾醇中生產麥角甾醇（真菌細胞膜的必需成分）所必需的，而羊毛甾醇14x一脫甲基酶是一種細胞色素P450酶，參與羊毛甾醇轉化為4，4-二甲基膽甾醇-8（9），14，24-三烯-3B-醇。

咪鮮胺有較弱的抗雄激素活性，能夠拮抗外周雄激素受體，減緩雄激素依賴性組織的生長發育;還能夠拮抗中樞雄激素受體，阻斷睪酮負反饋調節機制，引起腦垂體促黃體生成素分泌增多叫。類雌激素農藥對男性的影響尤為突出，表現為性腺發育不良、生殖道腫瘤和先天畸形增多。

因此，咪鮮胺也是一種新型內分泌干擾物，主要拮抗相關生殖激素受體發揮作用，因為它引發雙重作用機制并且通過阻斷雄激素受體和抑制胎兒類固醇生成起到抗雄激素的作用。體內咪鮮胺通過降低生殖器官的重量，影響前列腺中雄激素調節的基因表達和增加促黃體激素水平素。

2農藥咪鮮胺類雌激素作用的檢測方法

2.1整體動物試驗

一般整體動物試驗是通過動物試驗研究相關農藥受試物對哺乳動物生殖功能和發育過程的影響，預測其可能產生的對生殖細胞、受孕等的不良影響。對于雌性動物的測試，較經典的方法有子宮增重試驗1和陰道細胞角化試驗;此外，還有過氧化物酶活力測定8及子宮血管滲透性試驗凹。體內試驗的關鍵在于選擇合適的試驗動物和易于檢測的生理指標。如魚類卵黃蛋白原誘導試驗，就是根據正常雄性體內不會含有卵黃蛋白原，在大劑量人工雌激素作用下以及在低劑量類雌激素長期作用下，都能誘導體內卵黃蛋白原的生成，從而檢測經類雌激素農藥作用后的雄魚體內的卵黃蛋白原的含量來評價其毒性。有研究者提出一套將日本青鏘胚胎和幼魚暴露于排放污水中，通過對暴露后的胚胎損壞死亡情況、孵化率、孵化時間、幼魚畸形、平游失敗率、生長（體重、體長）、性別比率和死亡率等指標進行觀察和統計，從而評價排放污水的毒性和內分泌干擾效應的方法。

總之，雖然體內試驗法的結果可靠，但是要求大量的動物毒理學試驗，需要以犧牲大量的試驗動物為代價，并且花費大量的人力物力，而且持續周期較長。同時，不同種類的試驗動物，不同生長階段的同一種試驗動物對同一類雌激素農藥均可能表現出不同的試驗結果。因此，經體內試驗法得出的結論也有一定的局限性。

2.2離體細胞試驗方法

乳腺癌細胞7細胞（breastcancercells，MCF-7）來源于人乳腺癌細胞，其雌激素受體表達陽性，具有雌激素依賴性，并在暴露于雌激素化學物質后迅速增殖，廣泛應用于類雌激素農藥活性的評價2。因此，通過雌激素受體（ER）依賴性MCF-7細胞增殖試驗可以檢測農藥的雌激素活性2。具體的操作方法如下：將MCF-7細胞接種在含有細胞基礎培養液的6孔培養板中，在生長培養基中孵育24h后，用試驗培養基（含有待檢測物質的基礎培養液）代替原有的基礎培養基繼續培養6d，然后統計細胞數，從而研究其添加物對于MCF-7細胞生長的影響。另外，還可以檢測其對照組和不同試驗組培養液中雌激素水平的變化，最終決定其檢測物質的抗雌激素作用強度。

另外，還有E-SCREEN方法，就是試驗以利用雌激素對其靶細胞的增殖作用作為終點來評估環境化學物質的雌激素性，該定量測定法比較了在沒有雌激素（陰性對照）和存在17β-雌二醇（陽性對照）和一系列懷疑是雌激素的化學物質的情況下通過相似的MCF-7細胞接種物獲得的細胞數。目前，研究發現E-SCREEN測定法可以用來測量類雌激素農藥對于生殖方面的影響。具體方法是，用一系列濃度的化學品或目的樣品處理后，使用E2作為陽性對照，研究MCF7細胞的增殖情況。使用該測定法，發現多種化合物是雌激素的類似物，如烷基酚、鄰苯二.甲酸酯咪鮮胺等。進一步研究顯示，這些化合物可以結合ER并激活MCF7細胞中pS2（一種雌激素應答基因）的轉錄3E-SCREEN這樣的增殖試驗可能是高度敏感的，并且結果可能具有相關性，因為該系統利用表達可能介導雌激素效能的內源共激活因子的人源細胞。最近有研究報道，利用該技術進行了玉米赤霉烯酮及其衍生物的雌激素活性研究，測量暴露于這些霉菌毒素的ER陽性人乳腺癌細胞（MCF-7）的增殖，進一步發現，在6.25～25.00μM水平暴露后，通過使用E-Screen生物測定評估細胞增殖，其結果顯示了玉米赤霉烯酮及其衍生物在MCF-7細胞中的雌激素活性0。

2.3分子生物學方法

熒光素酶報告基因系統是以熒光素為底物檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報告系統，熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，其間會發出生物熒光，然后可以通過熒光測定儀測定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光07-18。可見，熒光素和熒光素酶這一生物發光體系，可以靈敏、高效地檢測基因的表達，是檢測轉錄因子與目的基因啟動子區DNA相互作用的一種檢測方法"8。目前，按照整個方法技術體系，構建了雌激素受體亞型介導的熒光素酶報告系統，開發了使用熒光素酶報告基因系統的人類雌激素受體（hERalpha）和hERbeta介導的報告基因測定，結果hERalpha報告基因系統對E2的最低檢測限為1.9x10-11mol/L，在1.9x10-8mol/L處獲得最高誘導倍數，是對照組的30.7倍。

分子生物學方法快速、靈敏、特異性高，使類雌激素農藥體外檢測試驗更易實現，可操作性強。用其他激素類受體（如雄激素受體、孕激素受體）替代該體系中的雌激素受體，就可以構建檢測環境雄激素和環境孕激素的試驗體系。因此，該方法的推廣性好。

3今后研究方向

農藥殘留弓發的問題涉及醫療、飲食建筑、造船、水產養殖等各行各業021，目前，對雌激素作用機制尚不清楚，對環境污染物雌激素生物活性的研究還處于探索性研究階段，僅可以根據有限的試驗數據推測哪些環境污染物可能具有雌激素活性，尚無足夠的在人體中負面效應的證據。因此，類雌激素農藥作用機制的深人研究對了解和確定一種環境污染物的雌激素性質十分必要。另一個研究方向即研究更多的化學品和其他壓力因素及其潛在累積影響。多年來，毒理學家傾向于避免研究累積效應，因為它被認為是一個棘手的問題。對于激素活性劑來說尤其如此，因為有大量的配體和多種來源，其中不僅包括人造化學物質，還包括植物中的化合物、內源性激素，甚至非化學應激物。最后，這方面的未來研究需要不斷拓展，這意味著關于內分泌系統特定組分的信息（例如特定的細胞培養反應）需要在全身生理學的背景下進行解釋2。

隨著分子生物學試驗方法的滲透、人類基因組計劃中人類基因圖譜的繪制完善，生物芯片中毒理芯片的研究很快將成為毒理學研究的前沿2-24，建立科學準確的環境污染物雌激素活性篩選方法、充分利用人類基因組計劃研究結果進行毒理芯片的研究是最理想的切人點。

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