Vimentin及E-鈣黏蛋白在早期乳腺癌診斷中的應用價值

郝文濤 張海雁

乳腺癌是女性惡性腫瘤中發病率最高的1種，占30%[1]。近年來一些研究發現上皮-間質轉化(EMT)與多種腫瘤的發生有關聯，包括卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肝癌等[2]，這種表達性的轉化使腫瘤細胞擺脫了細胞間的粘附，易于離散，更具有侵襲力，上皮性標志蛋白Vimentin和E-鈣黏蛋白被認為是EMT發生的重要標志[3]。因此，本研究擬探討通過檢測Vimentin和E-鈣黏蛋白來早期檢測乳腺癌的可行性及應用價值。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 資料

收集2013年4月至2017年4月來我院就診的早期乳腺癌患者60例，均經觸診、B超檢查及鉬靶檢查確診，并經病例確診為早期乳腺癌。經確診為TNMⅠ期乳腺癌35例，Ⅱa期乳腺癌25例，年齡26～65歲，平均年齡(48.32±12.42)歲；按部位：外上象限27例，外下象限15例，內上象限10例，內下象限8例；病理分型：浸潤性導管癌30例，粘液癌8例，導管內癌18例，低分化癌2例，乳腺分泌型癌1例，髓樣癌1例；選擇同期門診就診的良性乳腺疾病患者60例，作為良性對照組；良性乳腺疾病包括：急性乳腺炎20例，乳腺囊腫14例，單純性乳腺增生12例，囊性乳腺增生10例，其他4例。所有患者均知情同意，并簽署知情同意書。本試驗已通過本院醫學倫理委員會審查。

1.2 納入標準

①所有患者均為18～70歲；②均為首發乳腺癌患者，無其他惡性腫瘤；③均經觸診、B超檢查及鉬靶檢查確診，并經病例確診為早期乳腺癌；④無其他免疫系統疾病；⑤無嚴重的心腦腎疾病及多器官衰竭。⑥均自愿參加本次研究，且簽署知情同意書。

1.3 檢測儀器及方法

1.3.1 樣本采集 各組患者均在入院時采集外周血5 ml，4 ℃、3 000 r/min離心5 min后取血清，保存在-80 ℃超低溫冰箱中，等待檢測。

1.3.2 主要試劑 鼠抗人E鈣黏蛋白單克隆抗體1.5 ml購置于北京中衫生物工程公司；Vimentin鼠抗豬單克隆抗體1.5 ml購置于福州邁新生物技術公司。二抗試劑：二步法兔/鼠通用免疫組化試劑盒(100 ml，Dako real EnVision，HRP rabbit/mouse)試劑均保存于4 ℃冰箱保存，使用前按抗體說明書稀釋。

1.3.3 方法 免疫組織化學染色步驟：①將病理蠟塊連續切成4 μm均勻厚度的切片，置于60 ℃的烤箱中烤30 min后依次放入二甲苯及梯度乙醇中脫蠟；②將切片置于4 ℃冷藏后的枸櫞酸鹽緩沖液中，微波修復后自然冷卻；③滴加一抗，室溫孵育4 h；④滴加二抗，室溫孵育30 min；⑤滴加新鮮配置的DAB顯色劑于切片上，顯色1～3 min后自來水沖洗中指顯色；⑥蘇木精復染3 min，脫水后中性樹膠封片。

1.3.4 結果判定 采用雙盲法對結果進行判定E鈣黏蛋白為細胞質細胞膜染色，在光鏡下可見細胞質、細胞膜中均有陽性反應細胞，E鈣黏蛋白陽性染色呈棕黃色連續線裝；Vimentin陽性染色主要定位于胞質，呈棕黃色顆粒狀。分別在5個不同高倍視野相同范圍下計數500個細胞及免疫組化陽性細胞數。結果：①陽性細胞率<5%為(-)；②：陽性細胞率在5%～50%之間為(+)；③陽性細胞率在50%～75%為(++)，④陽性細胞率>75%為(+++)。檢測結果為(+)、(++)、(+++)則為陽性，(-)為陰性。

1.4 統計學分析

應用SPSS 17統計軟件對數據進行分析處理，計量資料采用均數±標準差進行描述，計數資料采用頻數或率進行描述，計數資料的比較采用卡方檢驗。乳腺癌組織中Vimentin與E-鈣黏蛋白表達的相關性分析采用McNemar分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Vimentin在組織中的表達

由表1可見，早期乳腺癌組患者Vimentin的表達陽性率高于良性對照組，差異具有統計學意義(χ2=62.48，P=0.000)。

表1 兩組患者Vimentin表達情況(例，%)

2.2 E-鈣黏蛋白在組織中的表達

由表2可見，早期乳腺癌患者E-鈣黏蛋白的表達陽性率低于良性對照組，差異具有統計學意義(χ2=25.49，P=0.000)。

表2 兩組E-鈣黏蛋白表達情況(例，%)

2.3 乳腺癌組織中Vimentin與E-鈣黏蛋白表達檢測結果分析

由表3可見，乳腺癌患者Vimentin檢測陽性率較高，而E-鈣黏蛋白在乳腺癌患者中檢測陽性率較低，差異具有統計學意義(χ2=21.55，P=0.000)。

表3 Vimentin與E-鈣黏蛋白表達檢測結果分析/例

3 討論

乳腺癌是當今世界威脅女性健康的第一殺手，女性發病率遠遠高于男性。全球每年約有120萬患者檢測出罹患乳腺癌，給女性的身體和心理造成了永久性的傷害，甚至危害女性的生命安全。但乳腺癌起病隱匿，缺乏早期的典型癥狀，很多患者一經發現已經到了進展期或晚期，65%的患者在查出乳腺癌的時候已經發生了轉移，即使做了根治性手術[4]，由于腫瘤組織增生能力強、無限增殖，并具有強大的侵襲力，也很難從根本上治愈，給預后帶來隱患。因此，我們需要找到一些特定的標志物，能夠幫助臨床醫生準確的判斷，識別乳腺癌，才能在臨床上真正做到“早發現，早診斷，早治療”。

上皮-間質轉化是指上皮通過一系列的變化獲得了間充質細胞的表型。而在這一變化的過程中細胞發生了極大程度的變化，包括細胞極性消失，細胞骨架重塑、細胞粘附力下降，并且獲得了侵襲、抗凋亡等生物學特性[5]。整個Emt過程的發展由多種生長因子及多條信號通路轉導信號共同調節。E-鈣黏蛋白便是Snai/E-cadherin信號通路上1種鈣依賴性細胞粘附分子[6]。該蛋白如果不能抑制下游調控分子，則會導致細胞粘附力降低，使腫瘤細胞更容易轉移到遠隔部位。目前已有研究表明，E-鈣黏蛋白的表達水平下降與多種腫瘤相關，包括胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、賁門癌、卵巢癌等[7-9]。在本次研究中，我們同時檢測了良性乳腺疾病患者于早期乳腺癌患者組織中E-鈣黏蛋白的表達，結果發現早期乳腺癌患者組織中E-鈣黏蛋白的陽性表達率低于良性乳腺疾病患者，且差異具有統計學意義(P<0.05).這一研究結果與鄧淼等[10]的研究一致。馬怡暉等[11]也在研究中發現，乳腺癌患者組織中E-鈣黏蛋白的表達水平低于正常組織，且差異具有統計學意義(P<0.06)。這一結果提示我們E-鈣黏蛋白的產生可能是腫瘤發生和發展道路上必經的一步，通過調控多種信號通路使上皮細胞發生EMT過程，從而增加了腫瘤組織的侵襲力。

Vimentin也EMT過程中的1種上調標志物蛋白，目前已經有很多報道研究表明Vimentin的表達增高與前列腺癌、結腸癌、肝癌、胃癌等有密切關系。本研究發現在早期乳腺癌患者中Vimentin檢測陽性率高于良性乳腺癌患者，差異具有統計學意義(P<0.05)。李裕明等[12]在一項原發性肝癌的研究中發現，E-鈣黏蛋白的表達與Vimentin的表達呈負相關，猜測可能是Vimentin的表達增加了癌細胞遷移和侵襲能力，而這是通過降低E-鈣黏蛋白的表達而實現的。周杰等[13]在顱咽管瘤中也發現了E-鈣黏蛋白的表達與Vimentin的表達呈負相關。

綜上所述，本研究結果提示，Vimentin與E-鈣黏蛋白均與乳腺癌存在密切關系，對乳腺癌早期診斷具有一定指示作用。同時，應該更加深入研究乳腺癌EMT發生機制，為乳腺癌的分子治療提供更有力的臨床依據。