miR-34a在乳腺癌中的表達及其臨床病理學意義

岳會珠 王桂菊 齊紅雙 許 麗

乳腺癌是1類具有較強家族遺傳性的惡性腫瘤，近年來發病率處于高位，最新的生物分子學研究[1]發現血清分子標記物對乳腺癌的診斷、治療和預后等多方面都可發揮顯著的作用。

微小RNA(Minimal RNA，miRNA)是1種非編碼單鏈小分子RNA，對某些mRNA具有特異性識別功能，轉錄后對mRNA的翻譯過程產生抑制，進而調控某些靶基因，發揮調節細胞生長、分化和凋亡等多種生命活動過程的作用。研究[2]證實miRNA的表達失調或功能失調在多種疾病特別是腫瘤的發生發展過程均發揮著重要作用，其根據腫瘤的具體發病部位而發揮調節致癌或抑癌基因的作用。miR-34a是1類具有高度保守的miRNA，在多種惡性腫瘤組織存在低表達量，被認為是具有重要潛力的血清分子標記物，但關于乳腺癌的研究較少[3]。因而，本研究深入探討了外周血中miR-34a在乳腺癌組織中的表達及其臨床病理學意義，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院病理科收集的乳腺癌組織標本80例(癌組織)、40例癌旁組織標本(癌旁組織)，收集時間2010年1月至2014年10月。乳腺癌患者年齡35～62歲，平均(53.4±8.8)歲，病灶最大徑≥3 cm 45例、<3 cm 35例；TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期26例、Ⅲ期34例；腫瘤類型：浸潤性導管癌23例、非浸潤性導管癌57例。癌旁組患者，年齡37～64歲，平均(52.0±9.3)歲，兩組研究對象的年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準[4]①乳腺癌的診斷標準參考人民衛生出版社《外科學》第八版中的標準；②患者年齡19～65歲；③標本均來源于手術后切除標本；④患者手術前無放化療史、免疫治療史；⑤本研究獲得醫學倫理委員會的批準。

1.2.2 排除標準 ①轉移性乳腺癌；②術后復發患者；③具有放化療病史；④未經病理學證實。

1.3 RT-PCR法

應用RT-PCR技術檢測兩組標本中的miR-34a表達水平，具體方法如下：Trizol法提取乳腺癌組織和癌旁組織總RNA，反轉錄法對提取的總RNA進行反轉錄并合成cDNA，試劑盒購于美國R&D公司，具體操作按照試劑盒說明書進行。SYBR Green法進行RT-PCR檢測，反應條件為15 s預變性，95 ℃；30 s 60 ℃；10 s 72 ℃，反應共40個循環并設3復孔對照[5]。

1.4 原位雜交方法技術

利用本室構建NOEY2真核表達質料NOYE-CR為模板，酶切后體外轉錄制備RNA探針，長約750 bp；NOEY2正義探針為陰性對照，GAPDH探針檢測相同組織為陽性對照[6]。

原位雜交后評分標準：根據著色強度：0分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色。當評分<2分定義為miR-34a低表達。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 兩組標本中的miR-34a表達水平比較

乳腺癌組織中的miR-34a表達水平顯著的低于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組標本中的miR-34a表達水平比較

2.2 乳腺癌標本中的miR-34a表達水平與其臨床病理學特征的關系

乳腺癌組織中的miR-34a表達水平與腫瘤TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移具有顯著的相關性(P<0.05)；乳腺癌組織中的miR-34a表達水平與患者年齡、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤類型、ER表達、PR表達無顯著關系(P>0.05)，見表2。

表2 miR-34a表達水平與乳腺癌臨床病理學特征的關系(例，%)

2.3 乳腺癌中miR-34a表達與其預后的關系

低表達miR-34a乳腺癌患者隨訪60個月生存21例(46.67%)、失訪3例，高表達miR-34a乳腺癌患者生存20例(64.52%)、失訪1例，兩組生存率比較差異無統計學意義(χ2=2.354，P=0.125>0.05)。

低表達miR-34a乳腺癌患者生存時間短于高表達miR-34a乳腺癌患者[Log Rank(Mantel-Cox) =3.928，P=0.047<0.05)](圖1)。

圖1 乳腺癌中miR-34a表達與患者預后的關系

3 討論

乳腺癌是發生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。女性乳腺是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的，乳腺癌中99%發生在女性，男性僅占1%[7]。流行病學研究[8]統計，乳腺癌已經成為女性健康問題的第一大危害，特別是城市白領，是這一疾病的高危人群。乳腺癌的病因尚未完全清楚，研究[9]發現乳腺癌的發病存在一定的規律性，具有乳腺癌高危因素的女性容易患乳腺癌。目前，化療藥物的治療和乳腺切除術是治療乳腺癌晚期的重要手段，其中化療是針對浸潤擴散型乳腺癌的治療最佳方法，但會誘發腎功能損傷、胃腸道反應和神經毒性等嚴重不良反應[10]。故而，探尋預估患者的化療療效和預后已成為臨床研究的重要方向。

miRNA是最近幾年發現的可調控腫瘤發生、發展過程的小分子RNA，對某些基因的位點可發揮靶向作用進而抑制腫瘤RNA的翻譯過程，研究[11]也證實乳腺癌與miRNA的遷移過程和病理發展過程關系密切，利用miRNA芯片技術檢測乳腺癌組織中的miRNA的表達情況，并與正常乳腺組織進行對比發現乳腺癌組織中存在多種miRNA的異常表達，其中miR-155、miR-29c、miR-365等均出現過表達情況，但miR-31、miR-127和miR-497均存在弱表達，該結果也提示我們不同的miRNA在乳腺癌的表達情況和發揮的作用也不盡相同。miR-34a是最近發現的一類miRNA，其在多類腫瘤中均存在表達水平的顯著下降并認為miR-34a可能具有抑制癌基因的重要保護功能，但現階段關于乳腺癌和miR-34a的研究較少。因而，本研究深入探討了外周血中miR-34a在乳腺癌組織中的表達及其臨床病理學意義。

本研究結果顯示乳腺癌組織中的miR-34a表達水平顯著的低于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.05)。上述結果說明miR-34a可能參與了乳腺癌的發生、發展過程，進而發揮抑制癌基因的作用。乳腺癌標本中的miR-34a表達水平與患者臨床病理學特征的關系結果顯示乳腺癌組織中的miR-34a表達水平與患者的TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移具有顯著的相關性(P<0.05)。該結果說明mir-30a具有抑制乳腺癌腫瘤轉移和生長的作用。miRNAs主要通過抑制靶基因的特殊位點降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻譯，進而對靶基因負性調控，發揮腫瘤轉移和生長的作用[12]。

乳腺癌組織中的miR-34a表達水平與患者的年齡、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤類型、ER表達、PR表達的情況無顯著關系(P>0.05)；低表達miR-34a乳腺癌患者隨訪60個月生存21例(46.67%)、失訪3例，高表達miR-34a乳腺癌患者生存20例(64.52%)、失訪1例，兩組生存率比較差異無統計學意義(P=0.125>0.05)。但低表達miR-34a乳腺癌患者生存時間低于高表達miR-34a乳腺癌患者(P=0.047<0.05)。上述結果說明miR-30a的表達異常可作為乳腺癌預后情況的獨立預測指標，并預測miR-34a可稱為乳腺癌治療的治療靶點之一。

現階段關于miR-30a在腫瘤組織的具體作用機制尚未得到完全解釋，張展[13]通過研究〗發現miR-30a可靶向整合抑制乳腺癌細胞的MDA-MB-435s和MCF-7的體外遷移、黏附和侵襲；程孟文[14]研究顯示miR-30a可作為作為細胞自噬抑制劑而抑制ATG5和BECN1的表達情況促進化療引發的細胞毒性應答作用。上述的研究均證實miR-30具有成為抑癌基因的潛力，并可成為1類特異性標志物對腫瘤的侵襲潛能和轉移狀態進行準確反映，但關于miR-30a基因關于乳腺癌發展機制的研究和與是否具有與其他基因相互作用還需進一步研究探討。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-34a低表達，并且與患者TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、不良預后有關。