UPLC-MS/MS法同時測定藥用乳香中7種乳香酸類成分

趙子熙 楊健 李靜 張小波 金艷 郭見強 郭蘭萍

摘要 目的：建立超高效液相色譜三重四級桿串聯質譜法同時測定不同來源乳香中7種乳香酸類成分的方法，比較不同來源乳香中該類成分的含量差異。方法：采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;以0.1%甲酸-水（A）-0.1%甲酸-乙腈（B）溶液為流動相，梯度洗脫，體積流量為0.5 mL/min，柱溫40 ℃;采用電噴霧離子源，正離子檢測方式，得到相應的提取離子流圖，以峰面積進行定量。結果：乳香中α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-α-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸和3-酮基-11α-羥基-β-乳香酸具有良好的線性關系，相關系數r均大于0.998 5，平均加樣回收率為96.8%～102.0%，RSD均<3.5%。結論：該方法操作簡便、準確、重復性好，為乳香中乳香酸類成分的深入研究及其質量控制提供了參考依據。

關鍵詞 乳香;乳香酸;超高效液相色譜-串聯質譜法;含量測定

Simultaneous Determination of 7 Boswellic Acids in Olibanum by UPLC-MS/MS

Zhao Zixi1，Yang Jian1，Li Jing1，Zhang Xiaobo1，Jin Yan1，Guo Jianqiang2，Guo Lanping1

（1 State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 Shandong Huafang Pharmaceutical Ltd.，Ji′nan 250000，China）

Abstract Objective：To establish a UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of 7 kinds of boswellic acids in Olibanum，and compare the contents in samples from different origins.Methods：The determination was performed on the ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）; the 0.1% formic acid-water（A）and 0.1% formic acid-acetonitrile（B）in gradient elution as mobile phase.The flow rate was 0.5 mL/min.The column temperature was 40 ℃.MS instrument was equipped with ESI+ ion source.Gaining the extracted ion chromatograms，then the peak area was used for quantitative.Results：The 7 kinds of boswellic acids：α-boswellic acid，β-boswellic acid，3-acetyl-α-boswellic acid，3-acetyl-β-boswellic acid，11-keto-β-boswellic acid，acetyl-11-keto-β-boswellic acid and 3-keto-11α-hydroxy-β-boswellic acid had good linearity，r>0.9985.The recovery rate was 96.8%～102.0%，with RSD<3.5%.Conclusion：The method is simple，accurate and repeatable，and provides a reference for in-depth research and quality control of boswellic acids in mastic.

Key Words Olibanum; Boswellic acid; UPLC-MS/MS; Content determination

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.007

乳香為橄攬科植物乳香樹Boszvellia carterii Birdw.（卡氏乳香樹）及同屬植物Boswcllia bhaurdajiana Birdw.（鮑達乳香樹）樹皮滲出的樹脂;乳香可分為埃塞俄比亞乳香和索馬里乳香，每種乳香又可分為原乳香和乳香珠[1]。目前，市面常見的乳香藥材有3種，我國習用品為索馬里乳香原和埃塞俄比亞乳香，歐美和印度習用品則為印度乳香（齒葉乳香樹Boswellia serrate Roxb.）[2]。乳香性溫，味辛、苦，歸心、肝、脾經，具有辛散溫通、調氣活血定痛、追毒、消腫生肌之功效，用于治療胸痹心痛，胃脘疼痛，痛經經閉，產后瘀阻，癥瘕腹痛，風濕痹痛，靜脈拘攣，跌打損傷，癰腫瘡瘍等癥[3]。乳香中富含三萜類成分[4]，其中具有五環三萜結構的乳香酸類成分報道較多[5-6];現代研究表明，乳香酸類成分具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗潰瘍[9]、改善記憶[10]等多種藥理活性。目前，國內研究文獻多側重于對乳香中11-羰基-β-乙酰乳香酸含量測定方法的研究，對其他同類成分的定量分析研究較少[2，11-12]。為了尋求更全面、更快速的乳香中乳香酸類成分的分析方法，本研究建立了同時測定乳香中7個乳香酸類成分α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-α-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、3-酮基-11α-羥基-β-乳香酸的UPLC-MS/MS分析方法。該法簡單快速，結果準確、可靠，為乳香中乳香酸類成分的深入研究及其質量控制提供了科學參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITY UPLCTM I-Class系統（美國Waters公司），API 6500四級桿-線性離子阱質譜儀（美國ABSCIEX公司，配有離子噴霧接口），New Classic MS-S電子天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）。

1.2 試劑 對照品α-乳香酸（批號：CFN98704-201710）、β-乳香酸（批號：CFN90221-201710）、3-乙酰基-α-乳香酸（批號：CFN90529-201710）、3-乙酰基-β-乳香酸（批號：CFN90530-201710）、11-羰基-β-乳香酸（批號：CFN90152-201710）、11-羰基-β-乙酰乳香酸（批號：CFN90531-201710）、3-酮基-11α-羥基-β-乳香酸（批號：CFN91039-201710）購自ChemFaces公司（湖北武漢），純度均≥98%;甲醇（色譜純，批號：I1014107923）、乙腈（色譜純，批號：JB081430）購自美國Fisher Scientific公司;甲酸（LC/MS分析用，美國Fisher Scientific公司，批號：A938-2000）;0.22 μm PTFE濾膜（天津津騰實驗設備有限公司，批號：TJMF50-2017101003）;水為自制超純水，來至賽默飛超純水系統（電阻率為18.2 M/cm，美國，型號GenPure）。

1.3 分析樣品 索馬里、印度、埃塞俄比亞乳香由山東華方藥業有限公司分別從當地采購;經中國中醫科學院金艷副研究員鑒定為乳香。12批乳香樣品：印度乳香4份（RX-1～RX-4），索馬里乳香3份（RX-5～RX-7），埃塞俄比亞乳香5份（RX-8～RX-12）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸-水（A）-0.1%甲酸-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（0 min，85% B;3.5 min，95% B），流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量1 μL。

2.2 質譜條件 離子源：Turbo V，電離模式：ESI+，氣簾氣（CUR）體積流量：30 L/min，噴霧電壓（IS）：+5 500 V，霧化氣（GS1）體積流量：50 L/min，加熱輔助氣（GS2）體積流量：50 L/min，采集方式：多反應監測模式（MRM），離子化溫度（TEMP）：550 ℃。優化的條件參數見表1。

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取7種乳香酸對照品適量，加無水乙醇配制成單一成分對照品儲備液。精密吸取各對照儲備液適量，分組配制成適量濃度的各混合對照品溶液，其中β-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乳香酸和3-酮基-11α-羥基-β-乳香酸為第一組，α-乳香酸、3-乙酰基-α-乳香酸和11-羰基-β-乙酰乳香酸為第2組，4 ℃下冷凍保存。

2.4 供試品溶液的制備 精密稱取樣品細粉0.2 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇20 mL，稱定重量，超聲提取30 min;放冷，再稱定重量，用無水乙醇補足減少的質量，搖勻，靜置，12 000 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。放置于4 ℃冰箱供UPLC-MS/MS分析用。

2.5 線性關系考察 將上述混合對照品溶液進一步稀釋成6個不同質量濃度的對照品溶液，按照2.1和2.2項下分析條件測定峰面積。以進樣濃度X（μg/mL）為橫坐標，色譜峰面積Y為縱坐標得到回歸方程分別為：α-乳香酸Y=1.18×105X+8.01×104（r=0.998 7），線性范圍10.0～200.0 μg/mL;β-乳香酸Y=2.43×105X+9.96×103（r=0.999 1），線性范圍20.0～400.0 μg/mL;3-乙酰基-α-乳香酸Y=1.02×105X+9.45×103（r=0.999 5），線性范圍1.0～50.0 μg/mL;3-乙酰基-β-乳香酸Y=7.19×105X+2.83×106（r=0.9991），線性范圍

30.0～600.0 μg/mL;11-羰基-β-乳香酸Y=1.26×105X+6.42×104（r=0.999 2），線性范圍10.0～200.0 μg/mL;11-羰基-β-乙酰乳香酸Y=4.59×105X+1.85×103（r=0.999 4），線性范圍20.0～400.0 μg/mL;3-酮基-11α-羥基-β-乳香酸Y=6.96×105X+1.73×104（r=0.998 7），線性范圍0.2～20.0 μg/mL。

2.6 精密度實驗 精密吸取同一混合對照品溶液，連續重復進樣6次，測得各乳香酸類成分的保留時間RSD在0.05%～0.47%，各成分峰面積RSD在0.22%～1.79%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 精密吸取同一乳香供試品溶液（RX-1），分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，測定并計算得到α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰基-α-乳香酸、3-乙酰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、3-酮基-11α-羥基-β-乳香酸峰面積RSD分別為2.5%、2.1%、3.6%、2.9%、3.6%、3.1%、4.2%，表明供試液樣品在12 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 取同一批乳香供試品粉末（RX-1），按2.4項下方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取1 μL進樣測定，計算得到上述7種乳香酸成分峰面積RSD分別為3.3%、2.9%、4.5%、3.5%、2.7%、3.6%、4.8%，表明該方法重復性良好。

2.9 回收率實驗 精密吸取已知含量的的印度乳香樣品（RX-1）6份，向其中精密加入等量已知濃度的的對照品溶液，加入無水乙醇稀釋至刻度定容混合均勻后，進行加樣回收檢測。按照2.1和2.2項下方法進樣分析，以計算所得的實際值與加入量的比值即為其回收率。見表2。

2.10 樣品測定結果 取12批乳香樣品，按2.4項下方法制備樣品溶液，按2.1和2.2項色譜條件下進樣測定。見表3。乳香中乳香酸類成分以3-乙酰基-β-乳香酸含量最高，平均含量達到21 286.8 μg/g;β-乳香酸平均含量次之，達到17 579.6 μg/g;11-羰基-β-乙酰乳香酸、α-乳香酸和11-羰基-β-乳香酸的平均含量均大于4 000 μg/g。3-乙酰基-α-乳香酸和3-酮基-11α-羥基-β-乳香酸含量較低，均在1 000 μg/g以下。

3 討論

本研究根據乳香酸類成分的性質及常用的提取方法，分別考察了提取方法（超聲提取、回流提取）、提取溶劑（甲醇、無水乙醇、丙酮）及提取時間（20 min、30 min、40 min），結果表明，無水乙醇作為提取溶劑，超聲提取30 min即可完全提取所測成分。此外，亦對液相色譜流動相和質譜參數進行篩選和優化，分別采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%乙

酸胺、（0.1%甲酸）乙腈-（0.1%甲酸）水等不同流動相，最終確定了最佳的色譜條件;同時發現乳香酸類成分在正離子模式下具有更好的響應，故選擇其作為質譜的離子化模式。

常允平等[12]采用性狀、顯微、TLC指紋圖譜和HPLC指紋圖譜4種技術對3種藥用乳香進行比較研究;結果表明，TLC指紋圖譜和HPLC指紋圖譜可在一定程度上區分3種藥用乳香，但均具有較大的局限性。而本研究結果表明，不同來源的乳香藥材中，索馬里乳香中未檢測到3-乙酰基-α-乳香酸，這可能是其與印度乳香和埃塞俄比亞乳香的重要區別。此外，索馬里乳香中3-乙酰基-β-乳香酸的平均含量達到37 156.9 μg/g，顯著高于其他2種乳香（P<0.000 1，圖1A）。索馬里乳香中β-乳香酸和11-羰基-β-乙酰乳香酸的含量亦高于其他2種乳香（P<0.01，圖1B、圖1C），分別達到19 209.0 μg/g和11 497.9 μg/g.索馬里乳香中3-酮基-11α-羥基-β-乳香酸的平均含量僅為81.6 μg/g，低于其他2種乳香（P<0.01，圖1D）。

2010年版《中華人民共和國藥典》開始收載乳香藥材，并采用氣相色譜法，分別以α-蒎烯和乙酸辛酯作為索馬里乳香和埃塞俄比亞乳香定性鑒別的標志成分。本研究采用UPLC-MS/MS聯用技術對不同來源乳香中的7種乳香酸類成分進行同時定量分析，該分析方法快速、準確，溶劑消耗少，分離效果及分析效率大幅度提升，可為乳香中乳香酸類成分的深入研究及其質量控制提供參考依據。

參考文獻

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（2019-10-15收稿 責任編輯：王明）

2020年中醫藥ISO國際標準提案項目申報指南

標準化有助于便利經貿往來、支撐產業發展、促進科技進步、規范社會治理。《世界中醫藥學會聯合會章程》規定：“研究、制定、發布與推廣中醫藥相關的國際組織標準，規范中醫藥管理，提升中醫藥的國際地位，促進中醫藥在世界各國（地區）健康有序地發展。”

2003年成立以來，世界中醫藥學會聯合會（以下簡稱“世界中聯”）一直把推動中醫藥國際標準化建設作為一項重要任務，目前已發布各類標準65部，同時積極參與ISO、WHO等國際組織的標準化活動，在中醫藥國際標準化活動中扮演著重要角色。

2009年，全球最大的標準制定者——國際標準化組織（ISO）成立了中醫藥技術委員會（ISO/TC249）。與國際貿易相關的標準是ISO關注的重點。2010年，世界中聯成為ISO/TC249的A級聯絡組織，有權直接向ISO/TC249提交標準項目提案、派遣專家參與中醫藥國際標準研制和參加各類會議。迄今為止，世界中聯已向ISO/TC249提交9項提案，包括基礎、管理、產品等方面，注冊專家二十余位，并派遣代表團積極參加ISO/TC249年會。

為積極履行ISO/TC249 A級聯絡組織職責，支持ISO/TC249中醫標準化發展，世界中聯現面向全球會員、專業（工作）委員會、產業分會及全球中醫藥專家征集2020年ISO國際標準提案項目，并同時申報世界中聯國際組織標準。

一、總體目標

重點征集ISO關注的標準領域，并與中醫藥產品、貿易密切相關的標準提案，讓中醫藥國際標準切實起到支撐全球中醫藥互聯互通，促進貿易便利、產業發展、科技進步的作用。

二、申報重點

2020年重點征集以下主題的提案項目：

（一）中藥產品

1.影響或制約中藥原料及制成品貿易的關鍵、通則標準;

2.有較大貿易量或較好貿易前景的藥材/中成藥/保健品等級、質量、安全標準。

（二）中醫藥特色設備/器械

1.中醫藥設備/器械的關鍵通用標準;

2.有較大貿易量或較好貿易前景的中醫特色診療，中藥生產加工、倉儲、運輸以及質量檢測等設備/器械的質量、安全、性能標準;

（三）中醫基礎信息

1.支撐中醫藥產品和服務貿易的基礎術語、信息標準;

2.基于計算機、互聯網的中醫藥信息服務相關標準;

三、申報程序

（一）申請

世界中聯全球會員團體（包括其專家）、個人會員以及各分支機構可在2019年12月29日之前向世界中聯秘書處國際標準部（E-mail：wfcms_isd@163.com）提交申請材料。2020年中醫藥ISO國際標準提案項目、世界中聯國際組織標準申報材料，詳見附件。

請注意：

1.提案均應是國際聯合提案，即提案工作組中至少應包括一名海外專家（包括中國香港、澳門、臺灣地區），一個項目中一個國家僅能有一位項目提案人;

2.已在本年度提交至ISO/TC249中方對口單位的提案不得重復申請，請勿一項提案項目多處投遞。

（二）評審

世界中聯秘書處國際標準部對申請材料進行形式審核，通過后組織專家對申請材料進行評審，并向申請者反饋評審結果。

（三）評審結論及反饋

1.評審結論為推薦項目，申請者應按照評審反饋的要求，在規定時間內將完善后的文件提交國際標準部，由國際標準部統一組織提交ISO/TC249秘書處，提案同時在世界中聯立項，開展相應研制工作;提案工作組中的1-2位專家以A級聯絡組織身份正式注冊為ISO/TC249專家，可接收ISO相關資料、參加ISO/TC249相關會議。

2.評審結論為不推薦項目，申請者應按照評審反饋的要求修改完善相關文件，項目進入世界中聯標準化項目后備項目庫。

（四）項目管理

由世界中聯提交ISO/TC249的項目，應接受世界中聯秘書處國際標準部的監督和管理。

四、聯系方式

世界中醫藥學會聯合會國際標準部

聯系人：楊麗雯、王麗麗

電話：86-10-58650051、86-10-58650150、15011298957

郵箱：wfcms_isd@163.com

世界中醫藥學會聯合會國際標準部

2019年11月29日

基金項目：國家重點研發計劃項目（2017YFC1701603，2017YFC1700701）;財政部中央本級專項（2060302）;科技基礎性工作專項（2013FY114500）;現代農業產業體系專項（CARS-21）;國家中醫藥管理局委托項目（GZY-KJS-2018-004）;國家自然科學基金青年基金項目（81603241）作者簡介：趙子熙（1998.05—），男，本科，研究方向：中藥分析，E-mail：925948417@qq.com通信作者：張小波（1980.10—），男，博士，副研究員，研究方向：中藥資源，Tel：（010）64081790，E-mail：jack110007@163.com