刺五加調控p38MAPK信號通路對順鉑所致小鼠耳毒性的防護作用

胡文良 孫學威 鄭艷秋

摘要 目的：探討刺五加對順鉑所致小鼠耳毒性的防護作用及對p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信號通路的調控作用。方法：將BALB/c小鼠根據隨機數字表法隨機分為空白組、模型組和實驗組，每組15只。除空白組小鼠外，其余3組小鼠均腹腔注射順鉑4 mg/kg，同時實驗組預先給予腹腔注射刺五加4 mL/kg，空白組給予等量生理鹽水干預，3組小鼠干預5 d后進行指標的檢測及評價。檢測3組小鼠聽性腦干反應（ABR）閾值及耳蝸組織細胞凋亡情況，蛋白免疫印跡法檢測3組小鼠耳蝸組織細胞p38MAPK信號通路相關蛋白表達情況。結果：與空白組比較，模型組8 Hz、12 Hz、24 Hz小鼠ABR閾移升高，差異有統計學意義（P<0.05），與模型組比較，實驗組ABR閾移降低，差異有統計學意義（P<0.05）。空白組、模型組和實驗組小鼠螺旋神經節細胞凋亡指數（AI）分別為（2.33±0.54），（19.76±0.84），（6.97±0.77），蛋白免疫印跡法檢測顯示，空白組、模型組及實驗組螺旋神經節p-p38MAPK蛋白相對表達分別為（0.22±0.03）、（0.93±0.02）、（0.64±0.04）;磷酸化環磷腺苷反應元件結合蛋白（p-CREB）相對表達分別為（0.19±0.04）、（0.84±0.05）、（0.43±0.02），與模型組比較，空白組和實驗組AI及螺旋神經節p-p38MAPK、p-CREB蛋白表達差異有統計學意義（P<0.05）。結論：刺五加可對順鉑所致小鼠耳毒性起到保護作用，其機制與調控p38MAPK信號通路蛋白表達抑制耳蝸細胞凋亡程序的發生有關。

關鍵詞 刺五加;耳毒性;順鉑;p38MAPK信號通路;細胞凋亡

Protective Effects of Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi on Cisplatin-Induced Ototoxicity in Mice by Regulating p38MAPK Signaling Pathway

Hu Wenliang，Sun Xuewei，Zheng Yanqiu

Abstract Objective：To investigate the protective effect of Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi on cisplatin-induced ototoxicity in mice and the regulation of p38MAPK signaling pathway.Methods：According to body mass stratification，BALB/c mice were divided into a blank group，a model group and an experimental group，with 15 mice in each group.In addition to the blank group，all the mice in the other groups were intraperitoneally injected with DDP 4 mg/kg，while the experimental group was given the same amount of saline in advance by intraabdominal injection of Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi 4 mL/kg.The indexes were detected and evaluated after 5 days of intervention in each group.The threshold of auditory brainstem response（ABR）and apoptosis of cochlear tissue cells were detected.The expression of p38MAPK signal pathway-related protein in cochlear tissue cells was detected by Western blot.Results：Compared with the blank group，the ABR threshold shift in the model group increased at 8 Hz，12 Hz and 24 Hz（P<0.05），and compared with model group，ABR threshold in the experimental group decreased（P<0.05）.The AI of spiral ganglion cells in the blank group，the model group and the experimental group were（2.33±0.54），（19.76±0.84），（6.97±0.77），respectively.WB detection showed that the relative expression of p-p38MAPK protein in spiral ganglion cells in the blank group，the model group and the experimental group were（0.22±0.03），（0.93±0.02），（0.64±0.04），and the relative expression of p-CREB protein was（0.19±0.04），（0.84±0.05），（0.43±0.02），respectively.Compared with the model group，the expression levels of AI and p-p38MAPK，p-CREB in the spiral ganglion of the blank group and the experimental group were significantly different（P<0.05）.Conclusion：Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi has protective effect on cisplatin-induced ototoxicity in mice.Its mechanism is related to regulating the expression of p38MAPK signaling pathway and inhibiting the apoptotic process of cochlear cells.

Key Words Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi; Ototoxicity; Cisplatin; p38MAPK signaling pathway; Apoptosis

中圖分類號：R283文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.017

順鉑（Cisplatin）化學名稱為二氯二氨合鉑，是目前國內外公認的具有廣譜抗癌作用的一線藥物，其是以二價鉑為中心的一種重金屬絡合物，與多種抗腫瘤藥物相協同且無交叉耐藥性，廣泛用于臨床多種實體腫瘤的治療，如頭頸癌、肺癌和卵巢癌等[1-2]。然而臨床不容忽視的一個問題是順鉑耳毒性不良反應較為嚴重，可導致雙側耳不可逆性聽力喪失[3]，且目前相關作用機制尚不明確。刺五加又名五加參，是五加科植物刺五加的根或莖，性溫、味辛、微苦、歸脾、腎、心經;主要應用于冠心病心絞痛、腦出血、高脂血癥、眩暈癥、慢性氣管炎及圍絕經期綜合征等多種疾病的臨床治療[4-5]。因此，嘗試采用刺五加治療順鉑所致小鼠耳毒性，并初步觀察其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級BALB/c小鼠，8周齡，體質量20～25 g;購于中國醫科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（遼）2018-0008。小鼠均分籠飼養，普通飼料喂養，自由飲水，動物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照。

1.1.2 藥物 刺五加注射液（黑龍江金九藥業股份有限公司，國藥準字Z23020808）;順鉑（南京制藥有限公司，國藥準字H20080177，批號：20131004）。

1.1.3 試劑與儀器 磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）、磷酸化環磷腺苷反應元件結合蛋白（p-CREB）抗體（美國Santa Cruz公司）等;CKX-31熒光倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司;FZ-10002電子天平，上海凡展衡器有限公司;TDZ4-WS/TDZ4WS臺式低速自動平衡離心機，湖南湘儀離心機廠;PAC1000型蛋白電泳及轉印系統，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將BALB/c小鼠根據隨機數字表法隨機分為空白組、模型組和實驗組，每組15只。除空白組小鼠外，其余3組小鼠均腹腔注射順鉑4 mg/kg，1次/d，連續注射5 d。

1.2.2 給藥方法 實驗組小鼠在腹腔注射順鉑前30 min預先給予腹腔注射刺五加4 mL/kg，空白組給予等量生理鹽水干預，3組小鼠干預5 d后進行指標的檢測及評價。

1.2.3 檢測指標與方法 1）3組小鼠聽性腦干反應（ABR）閾值的檢測：將3組小鼠腹腔麻醉后，參考相關文獻[6]進行ABR閾值的檢測，刺激聲為疏密相交替的次/秒的短聲，測試強度從95 dB nHL開始，5 dB為1檔逐級下降進行測試，ABR閾值判定以剛有Ⅰ波為準，同一刺激頻率下給藥前后的反應閾差值記為ABR閾移。2）3組小鼠耳蝸組織細胞凋亡情況：斷頭處死3組小鼠，暴露耳蝸，小心將蝸內組織及蝸軸取出，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，并制備石蠟切片，切片常規脫蠟至水，加入蛋白酶K工作液37 ℃反應30 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗后浸入封閉液中，室溫封閉10 min，滴加50 μL末端脫氧核苷酸轉移酶反應液，37 ℃濕潤避光反應60 min。滴加50 μL鏈霉親和素-辣根過氧化物酶工作液，37 ℃濕潤避光反應30 min。滴加DAB工作液，室溫顯色反應10 min。蘇木素復染，常規脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。參照TUNEL試劑盒的操作說明，以細胞核呈棕黃色或棕褐色染色為凋亡細胞，分別計數高倍視野下100個細胞中凋亡細胞數為凋亡指數（AI）。3）檢測3組小鼠耳蝸組織p38MAPK通路蛋白表達情況[7]：取部分蝸內組織，加入裂解液后冰上裂解30 min，BCA法定量后，取50 μg進行常規蛋白免疫印跡法（WB）檢測，經圖像分析系統分析3組細胞p-p38MAPK、p-CREB表達情況。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，計數資料用頻數表示，用χ2檢驗;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠ABR閾值的影響

與空白組比較，模型組8 Hz、12 Hz、24 Hz小鼠ABR閾移升高（P<0.05），與模型組比較，實驗組ABR閾移降低（P<0.05）。見表1。

2.2 3組小鼠螺旋神經節細胞凋亡比較

空白組螺旋神經節細胞形態清晰，細胞凋亡現象少;模型組螺旋神經節細胞核呈現棕黃色，凋亡現象明顯，實驗組凋亡現象較模型組明顯減少，細胞形態清晰。模型組小鼠螺旋神經節AI較空白組升高，且實驗組低于模型組（P<0.05）。見表2。

2.3 3組小鼠螺旋神經節中p38MAPK信號通路相關蛋白表達比較

模型組螺旋神經節p-p38MAPK、p-CREB蛋白相對表達量較空白組升高，而實驗組較模型組降低（P<0.05）。見表3、圖2。

3 討論

鉑類化療藥物在臨床應用中除對腫瘤的高活性外，胃腸道毒性、神經毒性、腎毒性、耳毒性等不良反應也是不容忽視的問題，嚴重影響腫瘤患者的生命質量[8]。近來臨床已采取相應措施防控鉑類藥物的腎毒性，但對于耳毒性的防治手段則較為落后，主要是因為對鉑類藥物耳毒性的發生機制尚不十分清楚。因此深入探討鉑類藥物耳毒性機制對于耳毒性的防治提供依據尤為重要。

順鉑耳毒性的基本病因之一是內耳微循環障礙造成耳蝸缺血、缺氧、自由基產生增多而使耳蝸內的結構受到損傷，刺五加注射液主要成分為刺五加總黃酮，是由刺五加的莖葉制成中藥制劑，多用于治療缺血性心腦血管疾病，其藥理作用包括擴張血管、促進和改善微循環、增加器官的血流量、減少組織耗氧量、清除自由基、調節機體新陳代謝和提高組織對缺氧的耐受性等[9-10]。本研究結果顯示，連續5 d腹腔注射順鉑后，模型組小鼠8 Hz、12 Hz、24 Hz小鼠ABR閾移明顯高于空白組，表明經順鉑干預后小鼠出現明顯的聽力下降現象，而在實驗組經刺五加注射液預處理后小鼠ABR閾移顯著低于模型組。提示刺五加注射液可能通過增加耳蝸的血液循環、改善內耳缺血缺氧狀態而減輕順鉑所致的毒性作用。研究指出，順鉑可誘導耳蝸NOX3表達水平的升高，促使細大量生成活性氧及發生脂質過氧化，進而MAPK/c-Jun氨基末端激酶細胞凋亡信號級聯，激活Bcl-2家族中促凋亡成員，使線粒體內細胞色素C釋放入胞質，使caspase-9和caspase-3蛋白轉錄激活后誘導耳蝸細胞發生凋亡，最終造成聽力喪失[11-13]。研究表明，刺五加多糖具有抗腫瘤、增強免疫力等作用[14-15];刺五加葉皂苷通過開放ATP敏感性鉀通道保護缺血心肌組織，降低組織損傷程度。張珊等[16]研究認為，刺五加注射液能抑制受損心肌細胞凋亡、減輕氧化應激損傷，有關有效減輕阿霉素誘導的大鼠心肌組織超微結構損傷，改善心功能。賈琳琳等[17]研究顯示，刺五加注射液可通過抑制谷氨酸及其受體在耳蝸螺旋神經節中的過度表達，對螺旋神經節細胞起到保護作用。

本研究經TUNEL檢測顯示，模型組螺旋神經節細胞核呈棕黃色，凋亡現象明顯，凋亡指數明顯高于空白組，而實驗組凋亡現象較模型組明顯減少，細胞形態清晰，凋亡指數也較模型組明顯降低。MAPK是調控細胞多種生理病理過程的重要信號傳導途徑，在細胞外信號的刺激下p38 MAPK信號通路磷酸化，激活下游轉錄因子，進而調控細胞的增殖、炎性反應和凋亡[18]。順鉑可激活MAPK信號通路[19];劉瑞婷等[20]發現，p38 MAPK通路的激活可導致神經細胞凋亡，p38 MAPK被磷酸化激活后，使效應細胞分泌多種細胞因子參與介導神經細胞損傷的過程。本研究結果顯示，經刺五加注射液干預后實驗組螺旋神經節p-p38MAPK、p-CREB蛋白相對表達量較模型組降低，提示其對順鉑導致的耳毒性的作用機制與調控p38MAPK信號通路蛋白表達抑制耳蝸細胞凋亡程序的發生有關。

綜上所述，從聽力學及耳蝸組織形態學等方面，本研究初步探討了刺五加注射液拮抗順鉑耳毒性的作用，在后續的實驗中會增加關于刺五加注射液作用濃度及作用時間的研究，進一步明確藥物的最佳給藥時間、濃度及方式等。

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（2019-09-05收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：內蒙古醫科大學科技百萬工程項目（KJbw2013014）作者簡介：胡文良（1969.04—），男，碩士研究生，主任醫師，研究方向：鼻息肉及耳聾耳鳴的治療，E-mail：13664881598@163.com