BP人工神經網絡結合正交試驗優化解毒止血顆粒的提取工藝

劉李梅 彭偉 涂禾 謝松 向猛 郭宏彥

摘要 目的：優選解毒止血顆粒的提取工藝。方法：以黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚含量以及干膏收率為評價指標，采用正交試驗聯合BP人工神經網絡考察加水量、提取時間、提取次數等因素的影響，利用層次分析法（AHP）綜合加權評分篩選解毒止血顆粒提取工藝。結果：最佳提取工藝參數為11倍量水，加熱回流提取3次，105 min/次。結論：優選的提取工藝科學合理，穩定可行。正交試驗聯合BP人工神經網絡優化方法實用高效，適宜于醫療機構中藥制劑研發需求。

關鍵詞 解毒止血顆粒;黃芩苷;漢黃芩苷;丹皮酚;層次分析法;正交試驗;BP人工神經網絡

Optimization of Extraction Process of Jiedu Zhixue Granule by BP Artificial Neural Network and Orthogonal Test

Liu Limei， Peng Wei， Tu He， Xie Song， Xiang Meng， Guo Hongyan

Abstract Objective：To optimize the extraction process of Jiedu Zhixue Granules. Methods：Taking the baicaline， wogonoside， paeonol content and dry extract yield as the evaluation index， the extraction process of Jiedu Zhixue Granule was researched by using the combination methods between orthogonal test and BP artificial neural network to study the influence of water addition， extraction time， extraction times etc.， and using the analytic hierarchy process （AHP） to weighted mark comprehensively for screening extraction process of Jiedu Zhixue Granule. Results：The optimum extraction process was as following： adding 11 times the amount of water， heating reflux extraction 3 times， and each time for 105 minutes. Conclusion：The optimal extraction process is scientific， rational， stable and feasible. The optimization method of orthogonal experiment combined with BP artificial neural network is suitable for R&D needs of TCM preparation in medical institution because of its practical and efficient characteristics.

Key Words Jiedu Zhixue Granule; Baicaline; Wogonoside; Paeonol; Analytic hierarchy process; Orthogonal test; BP artificial neural network

中圖分類號：R283.6文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.010

復方解毒止血湯是四川省骨科醫院多年的臨床工作經驗總結出來的，經醫院藥事委員會批準的協定方。處方含有黃芩12 g、黃芪20 g、黨參15 g、陳皮6 g、牡丹皮12 g、酒大黃6 g、酒黃連10 g、梔子10 g、紫花地丁20 g、蒲公英15 g等14味藥物組成，具有清熱解毒、消腫止痛、補氣血、止血的功效。此協定方在我院臨床使用量大，對治療損傷出血、創面滲血、創面感染癥、骨科術后感染[1]有獨特優勢，因此將其開發為醫療機構制劑具有重要意義。

目前可應用于中藥最佳工藝或最佳處方配比篩選的試驗設計、優化方法豐富，如正交設計[2-3]、均勻設計、混料設計、星點設計、人工神經網絡優化法、效應面優化法等，不同方法之間各有優勢，但也存在相應的局限性。如正交設計適宜于水平數<5的多因素多水平試驗，均勻設計適宜于水平數較多的試驗，混料設計適宜于處方配比的篩選，星點設計所涉及變量應為連續變量，且試驗次數相較于正交設計大幅增加[4]。

因此，本研究以黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚含量以及干膏收率為評價指標，采用層次分析法、正交試驗、BP人工神經網絡優選其最佳提取工藝參數，為后續開發為醫療機構制劑研究奠定基礎，同時探討正交設計-BP人工神經網絡優化聯用方法在醫療機構中藥制劑提取工藝研究環節的適用性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Waters，美國，型號：e2695、2489UV/Vis Detector）;XS105型分析天平（十萬分之一，METTLER TOLEDO公司，瑞士，型號：XS105）、電子天平（METTLER TOLEDO公司，瑞士，型號：PL202-L）;超純水機（重慶艾科浦公司，型號：AYJ1-0501-U）。

1.2 試藥 黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201720），漢黃芩苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq18031409），丹皮酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110708-201407）。黨參（批號：180816）、黃芪（批號：181022）、黃芩（批號：171014）、酒黃連（批號：180820）、白術（批號：180919）、牡丹皮（批號：180920）、酒大黃（批號：180302）、陳皮（批號：181008）、梔子（批號：171130）、甘草（批號：180926）、蒲公英（批號：180920）、紫花地丁（批號：181009）、仙鶴草（批號：180912），以上均購于四川省中藥飲片有限責任公司。經四川省骨科醫院涂禾主任中藥師鑒定，均符合2015年版中華人民共和國藥典相關標準。

1.3 試劑 乙腈、甲醇為色譜純（Fisher公司，批號174491、批號154449），其他試劑為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱Waters SymmetryShieldTM RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫（0～8 min：A 19%，B 81%;8～35 min：A 19%→50%，B 81%→50%;35～36 min：A 50%→100%，B 50%→0%;36～40 min：A 100%→19%，B 0%→81%），流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為274 nm，進樣體積10 μL。在上述色譜條件下，樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚的保留時間與對照品一致，成分色譜峰能達到較好的分離。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚對照品適量，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，分別制得每1 mL含黃芩苷478 μg，漢黃芩苷51.85 μg，丹皮酚48.84 μg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 稱取0.5倍處方量飲片共9份，按照正交設計表加水回流提取，趁熱濾過，合并濾液，定容。精密吸取提取液1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得9批供試品溶液，依次記為S1-S9。

2.4 陰性樣品溶液的制備 分別稱取缺黃芩陰性、缺牡丹皮陰性0.5倍處方量飲片2份，加10倍量水，回流提取1次，每次1 h，濾過，合并濾液，加水定容至1 000 mL。精密吸取提取液1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.5 專屬性試驗 分別精密量取2.1.2項下3種對照品溶液、2.1.3項下供試品溶液、2.1.4項下2種陰性對照溶液各10 μL，按2.1.1項下色譜條件分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果可見，陰性對照溶液在黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚峰保留時間處無干擾，專屬性良好。見圖1。

2.6 線性關系考察 將2.1.2項下所得對照品溶液分別稀釋，每個對照品溶液共6個濃度，得到一系列不同質量濃度的對照品溶液。取各個濃度的對照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到回歸方程與相關系數。見表1。

2.7 中間精密度試驗 精密吸取黃芩苷對照品溶液（23.90 μg/mL）、漢黃芩苷對照品溶液（51.85 μg/mL）、丹皮酚對照品溶液（24.42 μg/mL）10 μL，按2.1.1項下色譜條件連續進樣6次，測定各成分色譜峰峰面積。結果黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.30%、0.29%、0.17%，表明儀器精密度良好。

2.8 供試品溶液穩定性試驗 取供試品溶液S1，分別于制備后0、2、4、6、20、24 h，精密吸取10 μL進樣分析，測定各成分色譜峰峰面積。結果黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.28%、0.96%、0.15%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.9 重復性試驗 平行制備S1供試品溶液6份，精密吸取10 μL進樣分析，測定各成分色譜峰峰面積。結果黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.56%、0.01%、0.47%，表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密吸取已測定的供試品溶液S1 0.5 mL共6份，分別置于10 mL容量瓶中，精密加入黃芩苷對照品溶液（478 μg/mL）0.1 mL，漢黃芩苷對照品溶液（51.85 μg/mL）0.1 mL，丹皮酚對照品溶液（48.84 μg/mL）0.1 mL，精密吸取10 μL進樣分析，測定各成分色譜峰峰面積。結果黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚的平均回收率分別為101.72%、100.50%、98.53%，RSD分別為1.71%、1.25%、1.17%，表明該方法回收率良好。

2.11 干膏收率測定 精密吸取提取液適量，置于已恒重蒸發皿中，水浴蒸干，再置于烘箱105 ℃干燥至恒重，精密稱定重量，計算干膏收率（%）。

2.12 正交試驗優選提取工藝

2.12.1 浸泡時間及吸水率的考察 稱取0.5倍處方量飲片共3份，分別加入1 000 mL水，每隔30 min濾過，收集濾液，記錄剩余水量（mL）;直至藥材全部浸透心，剩余水量不再減少為止，計算藥材的吸水率（%）。結果：處方飲片的平均吸水率為228.40%，因此確定在首次提取時應多加2倍量的溶劑，浸泡時間為30 min后開始提取。

2.12.2 單因素考察

2.12.2.1 提取時間考察 稱取0.5倍處方量飲片共3份，各加10倍量水，分別回流提取60、90、120 min，濾過，定容至1 000 mL容量瓶中。精密吸取提取液1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。見表2。

結果：提取90 min時，黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚含量最高。

2.12.2.2 加水量考察 稱取0.5倍處方量飲片共4份，分別加入8、10、12、14倍量水，各回流提取60 min，濾過，定容至1 000 mL容量瓶中。精密吸取提取液1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。溶劑為12倍量水提取時，黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚含量最高;再增加溶劑用量，黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚含量差異無統計學意義。見表3。

2.13 正交試驗設計 根據單因素考察結果、臨床應用形式并結合生產實際，以加水量（A）、提取時間（B）、提取次數（C）為考察因素，安排L9（34）正交試驗，因素水平見表4。

2.14 指標權重的確立 基于處方藥味君臣佐使的配伍關系，確定各評價指標優先順序依次為黃芩苷>漢黃芩苷>丹皮酚>干膏收率，構建指標成對比較判斷優先矩陣[5]。見表5。根據表5評分結果，AHP法計算結果可得到黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、干膏收率4項指標的權重系數分別為48.72%、27.40%、13.30%、10.58%。一致性比率（CR）=0.012，CR<0.1，即判斷矩陣具有滿意的一致性，表明權重系數合理有效，可用在解毒止血顆粒提取工藝優選的綜合評分中。

2.15 含量測定及干膏率計算 按2.1.3項下方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣分析，測定各供試品中成分含量及提取液干膏率，結果見表6。

從方差分析結果可知，提取次數（C）對干膏率、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚的提取有顯著影響，為主要因素。加水量（A）、提取時間（B）對提取的影響不大，為次要因素。結合直觀分析，各因素作用主次為C>A>B，且C3>C2>C1，A3>A2>A1，B2>B3>B1，所優選最佳工藝確定為A3B2C3，即14倍量水、1.5 h/次、提取3次。

2.16 基于正交試驗的人工神經網絡優化 以正交試驗中加水量、提取時間、提取次數3個因素數值作為輸入層，以黃芩苷含量、漢黃芩苷含量、丹皮酚含量、干膏率數值作為輸出層，運用MATLAB（R2014b版本，Math Works，美國）軟件編程，建立BP人工神經網絡。采用Levenberg-Marquardt算法，最大迭代次數1 000次，網絡計算精度為1×10-5，建立并訓練網絡，很快即獲得性能與預測能力良好的BP人工神經網絡（均方誤差為2.02×10-6）。基于所建立的BP人工神經網絡模型，以加水量等3個因素值為自變量，并分別對3個因素制定合適的步長，采用MATLAB相關函數對每個因素定義域值進行編程，利用sim函數對網絡優化結果進行仿真輸出，以尋求輸出值最大組合。結果BP人工神經網絡模型仿真優化最佳提取工藝為：11倍量水，提取105 min，提取3次。

2.17 驗證試驗 稱取0.5倍處方量飲片，按正交設計試驗與BP人工神經網絡所優選最佳提取工藝參數，分別平行安排3組試驗，與正交試驗最佳工藝所得結果比較，BP人工神經網絡優化工藝試驗的考察指標均處于更優水平，且重復性良好，具有可操作性;同時節約能源。由此確定解毒止血顆粒最佳提取工藝參數為11倍量水，加熱回流提取3次，提取105 min/次。見表8。

3 討論

基于中藥多成分、多靶點的作用特性，多指標綜合加權評分是目前中藥提取工藝質量評價的重要手段。AHP法作為一種介于主、客觀權重系數法之間的賦權方法，既可體現研究者對各項指標的主觀重視程度，又可通過數學處理反映各項指標之間的相互聯系與影響，降低經驗性權數法的主觀影響，使各指標權重系數具有較好的合理性和科學性，目前已被廣泛應用于中藥的提取工藝研究并具較好的實用價值[6-8]。

正交試驗因其“均勻分散、整齊可比”的特點，在篩選影響因素主次、優化最佳參數組合等方面的研究中應用廣泛，但受限于因素水平的設定，正交試驗所篩選出的最佳參數只是已設水平的組合，有可能只是較優組合而非最佳組合。BP人工神經網絡基于其輸入層、隱藏層、輸出層的三層神經網絡結構，可通過相應函數完成輸入層與輸出層的高度非線性擬合，從而實現對多因素多指標的試驗優化。因此，通過正交試驗獲得訓練數據和樣本，再利用BP人工神經網絡進行優化篩選的方法，只需進行較少次數試驗即可獲取理想試驗參數組合，可操作性強，目前在中藥炮制工藝與提取工藝的相關研究中均有應用[9-11]。

本文聯合多種方法得出解毒止血顆粒最優提取工藝參數，為制劑開發奠定基礎。但是本文僅基于解毒止血方在臨床以湯劑的形式給藥，采用正交試驗聯合BP人工神經網絡優選出解毒止血湯水提工藝參數，未比較其他溶劑提取。下一步擬將醇提工藝優選，并結合水提、醇提2種提取物的藥效學實驗確定最優的提取工藝。

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（2019-05-21收稿 責任編輯：王明）

基金項目：四川省骨科醫院科研課題項目（2017-9）作者簡介：劉李梅（1988.10—），女，碩士研究生，中藥師，研究方向：中藥新制劑、新技術，E-mail：834321452@qq.com通信作者：涂禾（1965.05—），男，本科，主任中藥師，研究方向：中藥制劑、醫院藥事管理及臨床藥學，E-mail：297983480@qq.com