SD大鼠哮喘模型建立方法及評價的比較研究

史琦 李春雷 孔艷華 龍泓竹 李陽溪 閻玥 李友林

摘要 目的：觀察不同致敏液成分、致敏液注射部位、激發液濃度、激發時長所造成的SD大鼠哮喘模型的差異，旨在建立一種較為成功的哮喘大鼠模型。方法：分別以10% OVA/Al（OH）3混合液1 mL和10%OVA/Al（OH）3+百日咳桿菌混合液1 mL作為致敏液;注射部位分為腹腔注射和五點注射（雙側足心、雙側腹股溝皮下、腹腔）;以1%OVA或2%OVA作為激發液;激發時間包括7 d和21 d;經上述方法不同組合疊加造模后評價大鼠的一般活動狀態、肺組織病理及肺功能檢測結果。結果：OVA+百日咳腹腔注射組和OVA+百日咳五點注射組大鼠出現呼吸急促，呼吸困難等典型的哮喘癥狀，OVA腹腔注射組1部分大鼠出現較輕程度的哮喘癥狀，其余各組哮喘癥狀不明顯。病理結果顯示：OVA+百日咳五點注射組大鼠可見大量的嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤、管腔狹窄、黏液栓生成、支氣管痙攣;OVA腹腔注射組1和OVA+百日咳腹腔注射組主要表現為淋巴細胞浸潤和杯狀細胞較多;其余各組病理改變不明顯。肺功能結果顯示：疊加了百日咳后的腹腔注射組和五點注射組大鼠的I值和Rn值均較單純OVA腹腔注射組升高，五點注射組大鼠的氣道高反應性升高更加明顯（P<0.01）。結論：OVA結合滅活百日咳桿菌共同致敏、多點皮下注射聯合腹腔注射能比較成功的構建SD大鼠哮喘模型。

關鍵詞 SD大鼠;哮喘;造模;模型評價

Comparative Study on the Establishment Method and Evaluation of SD Rat Asthma Model

Shi Qi， Li Chunlei， Kong Yanhua， Long Hongzhu， Li Yangxi， Yan Yue， Li Youlin

Abstract Objective：To observe the differences of SD rat asthma models with different methods of sensitization fluid composition， sensitized injection site， atomization liquid concentration and time， aiming to establish a more successful asthma rat model. Methods：The10% OVA/Al（OH）3 mixture 1 mL or 10% OVA/Al（OH）3+ pertussis mixture 1 mL were taken as the sensitization fluid respectively; sensitized injection site was abdominal injection or 5 points injection （bilateral foot heart， bilateral inguinal subcutaneous and abdominal injection）; using 1% OVA or 2% OVA as the excitation liquid; excitation time including 7 days and 21 days. General activities， pulmonary pathology and pulmonary function detection were evaluated by different combination methods of factors above. Results：Typical asthmatic symptoms such as shortness of breath， dyspnea and so on in OVA+ pertussis abdominal injection group and OVA+ pertussis 5 points injection group rats were obvious. Mild asthma symptoms were observed in the first OVA group rats， and asthma symptoms in other groups were not obvious. The pathological results showed that OVA+ pertussis 5 points injection group rats showed a large number of eosinophils and lymphocytes infiltration， bronchostenosis， mucus production and bronchospasm. The first OVA group and the OVA+ pertussis abdominal injection group rats showed infiltration of lymphocytes and goblet cells. The pathological changes in the other groups were not obvious. Results of lung function showed that： I and Rn values of OVA+ pertussis 5 points injection group and OVA+ pertussis abdominal injection group rats increased compared with those of the OVA abdominal injection group. Hyperresponsiveness of OVA+ pertussis 5 points injection group increased more significantly （P<0.01）. Conclusion：Sensitization with both OVA and pertussis， multipoint subcutaneous injections combined with abdominal injection can successfully construct the asthma model in SD rats.

Key Words SD rats; Asthma; Model building; Model evaluation

中圖分類號：R285.5;R256.12;R-332文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.014

支氣管哮喘（Bronchial Asthma，BA）簡稱哮喘，是由多種細胞包括嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等及細胞組分參與的氣道慢性炎性反應性疾病。臨床表現為反復發作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽，近年來認識到哮喘是一種異質性疾病。全球哮喘患病率呈逐年增長的趨勢，西歐近10年間哮喘患者增加了1倍，美國自20世紀80年代初以來哮喘患病率增加了60%以上，亞洲的成人哮喘患病率為0.7%～11.9%（平均≤5%）。我國目前至少有3 000萬左右的哮喘患者，其中老年人是繼青少年之后的第二大哮喘發病高峰人群[1-3]。《全球哮喘病負擔報告》的研究數據來自全球80多個國家和地區，該報告顯示當時全球范圍內約有3億人患有哮喘病。預計到2025年，如果全球人口的城市化比例從45%升至59%，則哮喘病患者將有可能達到4億人[4]。

BA是臨床常見、多發、難治病，如何提高BA的防控水平、減輕患者經濟負擔、減少患者致殘率和降低勞動力喪失等已成為眾多學者探討的重點和熱點。動物模型是用來識別和檢測哮喘發病機制與哮喘表型發展關系的理想的工具，人類利用動物模型研究哮喘已百余年的歷史[5]。在研究探索BA防治過程中，穩定的動物模型的建立、復制及科學評價成為BA實驗研究成功與否的關鍵點。目前嚙齒動物（近交系小鼠和大鼠）和豚鼠模型是最常使用的BA動物模型。近年來轉基因技術及物種特有的探針的發展，也有利于哮喘詳細的機制研究[6]。目前，BA動物模型仍存在著造模方法不一、動物種類繁多、模型評價指標不統一以及動物與人類哮喘發病過程差異性大等諸多問題。

本研究在綜合了相關文獻調研及前期研究結果[7-9]的基礎上，比較不同致敏液成分（不同佐劑）、致敏注射部位、激發液濃度及激發時長所制備的SD大鼠哮喘模型的差異，并結合大鼠一般活動狀態、肺組織病理及肺功能檢測進行模型綜合評價，以期建立起穩定、可復制的SD大鼠哮喘模型，規范評價方法，為后期的中藥干預性機制、機制研究奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性SD大鼠共48只，平均體質量（170±10）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[合格證書號：SCXK（京）2009-0007]，于中日友好醫院臨床研究所動物室常規飼養。

1.1.2 試劑與儀器 血清卵蛋白干粉（ovalbumin，OVA，Alfa，USA，批號：A16951）;氫氧化鋁Al（OH）3（Sigma，批號：A4682）;百日咳類毒素（Sigma，批號：P7208）;3%戊巴比妥鈉（上海國藥集團化學試劑有限公司，批號：WS20050411）。超聲霧化器（江蘇省魚躍醫療設備有限公司，型號：402AI）;倒置光學顯微鏡、普通光學顯微鏡（Olympus，Japan，型號：BX51）;動物呼吸動力參數及肺功能測定系統（SCIREQ，Canada，型號：flexlVent FX），由中國醫學科學院藥物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 動物分組采用Excel表隨機數字分組法。造模采用卵蛋白與氫氧化鋁混合液致敏大鼠后再行卵蛋白激發，并結合百日咳桿菌注射的方法。根據注射部位、致敏藥物及藥量、霧化天數及藥量的不同，造模過程共分為2次實驗，具體分組及操作方法見表1、表2。

1.2.2 取材與標本制備 各組大鼠最后1次霧化激發后用戊巴比妥鈉按50 mg/kg體質量劑量麻醉。迅速打開胸腔，迅速分離出右肺上、中、下葉。其中，右肺中葉置于新鮮配制的中性4%多聚甲醛固定液中放置72 h（室溫）后，石蠟包埋，連續切片，厚度4 μm，常規蘇木素-伊紅（HE）染色。

1.2.3 模型評價指標

1.2.3.1 大鼠一般情況 記錄大鼠是否出現煩躁、搔鼻、呼吸加快、口唇發紺、腹肌痙攣、點頭呼吸及四肢癱軟等表現。

1.2.3.2 肺組織病理變化 觀察造模后肺組織病理切片HE染色是否表現為氣道大量炎性細胞浸潤，支氣管黏膜上皮腫脹、成片脫落、黏膜腺體細胞（杯狀細胞）增生，部分肺泡間隔增厚，支氣管痙攣等。

1.2.3.3 肺功能檢測方法及評價指標 末次霧化激發24 h后以10%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，喉鏡行氣管插管，確認插管成功后（與喉鏡配套使用的手持鏡片，插管成功后鏡片上大鼠呼出氣體清晰可見）將其與肺功能儀固定，進行肺功能測定。相關參數設定為：強力呼吸頻率120次/min，深呼吸頻率30次/min。所測得的指標：IC（深吸氣量），Crs（動態順應性），Rn（中心氣道阻力），G（組織阻尼），H（組織遲滯），I（氣道高反應性），Cst（靜態順應性）。觀察造模后大鼠肺功能檢測是否表現為氣道阻力增加、氣道高反應性等。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。結果以均數±標準差（±s）表示。若符合正態分布和方差齊性，則采用獨立樣本t檢驗或方差分析;若不符合正態分布或方差不齊，則進行非參數檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 1）2次造模實驗中，正常組大鼠均表現為精神活潑，反應靈敏，呼吸平穩，皮毛光潔，未出現呼吸急促、困難或喘鳴音等癥狀。其余造模組大鼠均不同程度出現精神萎靡、拱背蜷縮等表現。2）OVA+百日咳腹腔注射組和OVA+百日咳五點注射組大鼠出現躁動不安、搔抓顏面皮毛等過敏癥狀，繼而俯伏不動，出現呼吸急促，呼吸困難伴輕度紫鉗，部分大鼠可聞及響亮的呼氣相哮鳴音，口鼻流出黏液，可出現呼吸不規則、排尿排便增多等癥狀。反復激發后大鼠消瘦、咳嗽喘息、毛色黃澀失去光澤且時有脫落，嚴重者精神不振、反應遲鈍、四肢癱軟，2組中以后者癥狀更加明顯。3）OVA腹腔注射組2大鼠僅表現為精神萎靡、拱背蜷縮，未觀察到明顯的哮喘癥狀。OVA腹腔注射組1部分大鼠出現打噴嚏、焦躁不安、撓鼻、呼吸急促、腹肌痙攣等肉眼可見癥狀，但哮喘程度明顯弱于OVA+百日咳復合注射組。

2.2 肺組織HE染色結果 1）正常組大鼠肺組織HE染色結果未見炎性細胞浸潤，肺泡擴張良好、支氣管黏膜和管壁厚度正常，且肺泡、支氣管黏膜上皮結構完整清晰，支氣管無痙攣。2）OVA+百日咳五點注射組大鼠可見肺組織內有不規則暗紅色充血區，支氣管和血管平滑肌輕度增生，在大中氣道和血管周圍伴有大量紅染的嗜酸性粒細胞及紫藍色簇狀淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，管腔狹窄，管壁明顯增厚，支氣管黏膜上皮細胞排列紊亂、成片脫落，杯狀細胞增生明顯，支氣管內有大量黏液栓生成，支氣管痙攣，巨噬細胞增多等典型BA病理表現。3）其余3個造模組可見肺組織炎性細胞浸潤，支氣管黏膜上皮細胞排列紊亂、成片脫落，肺泡間隔增厚，支氣管痙攣，巨噬細胞增多等病理表現，但病理損害輕重程度不同，且均較OVA+百日咳五點注射組程度輕。其中，OVA腹腔注射組2大鼠支氣管管腔基本正常，上皮輕度增生，管腔未見明顯狹窄，管壁炎性反應較輕，少數支氣管周圍有淋巴細胞侵潤灶，支氣管和血管平滑肌輕度增生，杯狀細胞較少;OVA腹腔注射組1和OVA+百日咳腹腔注射組肺組織哮喘病理程度較上述2組稍重，主要表現為淋巴細胞浸潤和杯狀細胞較多。見圖1。

2.3 大鼠肺功能檢測結果 肺功能結果顯示：同正常組比較，OVA腹腔注射組1大鼠I（氣道高反應性）和Rn（中心氣道阻力）升高，G（組織阻尼）和H（組織遲滯）降低;OVA腹腔注射組2大鼠I值和Rn值降低，G值和H值升高，說明單純OVA腹腔注射造模方法后，大鼠的氣道高反應性指標和阻力指標出現升降不同的變化，不能完全符合哮喘病變特點。實驗2中疊加了百日咳后的腹腔注射組和五點注射組大鼠的I值和Rn值均較單純OVA腹腔注射組升高，五點注射組大鼠的氣道高反應性升高更加明顯（P<0.01）;同時，這2個組大鼠的IC（深吸氣量）和Cst（靜態順應性）較OVA腹腔注射組有不同程度的降低，但差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1、表2。

圖1 SD大鼠肺組織病理組織學結果（HE染色，×20） 注：正常組;B：OVA腹腔注射組2;C：OVA腹腔注射組1;D：OVA+百日咳腹腔注射組;E：OVA+百日咳五點注射組;標尺=200 μm

3 討論

目前，大多數BA動物模型復制的是“經典”的Th2哮喘表型，這些模型的特征是具有高水平的特異性抗原IgE，以嗜酸粒細胞為主的呼吸道炎性反應，Th2細胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13[6]。用于哮喘研究的動物模型主要有小鼠、大鼠、豚鼠，體積較大的動物如貓、兔、羊、犬及靈長類動物。不同種類的造模動物各具優缺點。實驗用大鼠品系純、來源廣、易飼養，相關生物學試劑易獲得，標本采集量較小鼠充足，對抗原反應較為一致，可在麻醉條件下進行氣道高反應性檢測及評價，能出現與人類哮喘類似的遲發相哮喘反應且反應出現的時間與哮喘患者接近，有氣道反應性增加和嗜酸粒細胞浸潤等優點，因而成為近年來研究的熱點，我國主要使用SD和Wistar大鼠[10-13]。

OVA是最早的并且是目前建立BA動物模型中使用最廣泛的致敏原，分為單純OVA和復合OVA（含佐劑，主要是氫氧化鋁）2種。最為經典的模型為給予豚鼠腹腔注射10%OVA致敏14 d后再以1%OVA霧化吸入激發，霧化過程中持續至豚鼠出現煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁等BA癥狀為止，1次/d，共7 d。以往研究顯示，按照上述經典方法造模，模型動物肺組織病理觀察可見細支氣管及周圍炎性細胞浸潤明顯，管腔中炎性細胞及黏液增多，管腔變小[14-15]。本研究中，OVA腹腔注射1、2組均為參考經典方法進行SD大鼠造模，2組的區別在于霧化激發的開始時間、霧化天數及霧化液濃霧的不同。OVA腹腔注射組2大鼠經造模后氣管管腔基本未見狹窄，炎性細胞浸潤程度較輕，與以往研究結果不完全相符合。OVA腹腔注射組1大鼠造模后病理變化較組2加重，表現為淋巴細胞浸潤明顯增多、杯狀細胞增多，肺功能的結果也顯示，OVA腹腔注射組1大鼠的氣道高反應性和中心氣道阻力升高，但這種造模方法霧化OVA濃度加倍，實驗過程中更容易造成動物的死亡，且霧化時間共計21 d，加重實驗負擔。

佐劑作為免疫增強劑，常與抗原物質一起注射或預先注人機體后，影響機體免疫調節網絡，使機體更早、更有效、更持久地產生免疫應答。具有免疫原性的佐劑有百日咳桿菌、結核分枝桿菌和枯草桿菌等;非免疫原性佐劑有氫氧化鋁、液態鋁、硫酸鋁鉀和明礬等。多數文獻中采用的氫氧化鋁作為OVA致敏哮喘模型佐劑的方法，常因兩者的混合度差而影響致敏的效果[16]。哮喘病因復雜、發病機制涉及多種細胞和細胞組分的參與，必須根據研究的需要選擇合適的哮喘動物模型，經典的卵蛋白激發哮喘模型不是適用于所有情況，必要時要根據實驗目的進行改進或創立新的哮喘模型。其實驗中采用了卵蛋白、氫氧化鋁及滅活的百日咳桿菌混合為造模液，同時提高霧化液的濃度，結果顯示成功復制了BA大鼠模型[17]。采用3種不同的方法進行哮喘模型的建立研究顯示，OVA+百日咳桿菌共同致敏和OVA單獨致敏均可以顯著增加大鼠BALF中的白細胞數量，同時可增加嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞的數量，而百日咳單獨致敏僅僅嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的數量有影響，且增加作用不明顯，可知OVA致敏在哮喘模型復制中仍起關鍵作用[18]。本次實驗研究中，OVA+百日咳腹腔注射組肺組織病理程度與OVA腹腔注射組1類似，較OVA腹腔注射組2稍重，主要表現為淋巴細胞浸潤和杯狀細胞較多，但并未顯著的提高造模的成功率。

綜合目前國內BA動物模型的研究情況，模型制備的影響因素主要包括：實驗動物種類、品系、性別、體質量、年齡差別;霧化液成分雖有不同，但仍以卵蛋白激發最為常用;多數造模過程中均加用致敏佐劑氫氧化鋁和滅活百日咳桿菌;致敏液的濃度以10%的卵蛋白1 mL或100 g/L卵蛋白1 mL居多;激發的方式一般分為霧化激發或滴鼻激發;激發頻率的差異較大，如激發2次/d、每天激發、隔天激發、1周激發1次等;每次激發時間為20 s至1 h不等;激發的總時長為1～6周不等，慢性哮喘模型制備連續激發12周[19]。有學者采用組胺激發對SD大鼠進行篩選建立哮喘急性和慢性模型，在大鼠最后1次激發后5 h，背部皮內多點注射OVA生理鹽水溶液。被動皮膚過敏反應結果顯示，模型組皮膚藍斑面積較正常對照組顯著增大，慢性模型組皮膚藍斑面積明顯大于急性模型組。說明多點注射、反復激發的方法可能使模型處于更嚴重的致敏狀態[20]。在本次研究中，OVA+百日咳五點注射組大鼠在本次實驗中呼吸急促、輕度發紺及咳嗽喘息最為明顯，病理染色結果顯示嗜酸性粒細胞及淋巴細胞浸潤程度最重，可見明顯的支氣管管腔狹窄、管壁增厚和大量黏液栓生成等典型的哮喘病理表現，同時肺功能檢測中氣道高反應性升高也更加明顯。

綜上所述，OVA結合滅活百日咳桿菌共同致敏較單獨使用OVA致敏效果突出，多點皮下注射聯合腹腔注射的造模成功率高于單純腹腔注射，同時適當提高霧化激發液的濃度可以加重模型大鼠的肺病理損傷程度。

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（2018-11-06收稿 責任編輯：芮莉莉）

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（81403377）;北京市科學技術委員會“十病十藥”研發項目（Z161100001816004）作者簡介：史琦（1983.09—），女，博士研究生，主治醫師，研究方向：中醫藥防治肺系及過敏性疾病的臨床及基礎研究，E-mail：shiqi19830910@163.com通信作者：李友林（1961.07—），男，碩士研究生，主任醫師，中日友好醫院中醫肺病二部主任，國家中醫藥管理局重點研究室（肺病慢性咳喘）主任，中醫藥防治過敏性疾病北京市重點實驗室主任，研究方向：中醫藥防治肺系及過敏性疾病的臨床及基礎研究，Tel：（010）84206023，E-mail：lyl19610721@163.com