加味身痛逐瘀湯對骨質疏松模型大鼠療效及作用機制探討

韓鵬勃 蔣鋒 姚亞波 韓剛

摘要 目的：探討加味身痛逐瘀湯對骨質疏松模型大鼠療效，同時觀察其對生物力學及骨代謝水平的影響。方法：將80只雌性wistar大鼠納入研究，隨機分為空白組（n=10）及造模組（n=70），所有造模組大鼠接受切除子宮模擬骨質疏松模型。將60只造模成功大鼠隨機分為安慰組、對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組15只。其中中藥組大鼠接受加味身痛逐瘀湯灌胃，高劑量組（1.32 g/mL）、中劑量組（0.66 g/mL）、低劑量組（0.33 g/mL），灌胃1次/d，連續灌胃3周;安慰組大鼠接受生理鹽水灌胃，10 mL/次，1次/d，連續灌胃3周;對照組大鼠給予降鈣素注射液注射，2次/周，連續注射3周。3周后檢測各組右側股骨大鼠骨生物力學相關數據、右側脛骨骨礦物密度和骨小梁結構變化、血清骨鈣素、血清I型膠原氨基端肽原（PINP）濃度變化。結果：1）與空白組比較，造模組大鼠彈性模量、最大載荷降低（P<0.05），與安慰組比較，對照組及中藥組彈性模量、最大載荷顯著升高（P<0.01）。隨著劑量的增加，中藥組大鼠彈性模量、最大載荷顯著增高（P<0.05）。2）與空白組比較，造模組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低（P<0.05）;與安慰組比較，對照組及中藥組骨密度顯著升高（P<0.01）;加味身痛逐瘀湯中劑量組和高劑量組大鼠骨密度較低劑量組增高（P<0.05）。3）與空白組比較，造模組血清BGP和PINP均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與造模組比較，中藥組血清BGP和PINP均明顯降低，隨著加味身痛逐瘀湯濃度增加BGP和PINP下降的趨勢更明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：加味身痛逐瘀湯可能通過降低骨質疏松模型大鼠血清BGP和PINP含量，提高骨生物力學性能，糾正骨退行性改變，實現治療骨質疏松的目的。

關鍵詞 骨質疏松;加味身痛逐瘀湯;骨密度;生物力學;骨代謝;骨結構;BGP;PINP

Clinical Effects and Mechanism of Jiawei Shentong Zhuyu Decoction on Osteoporosis Model Rats

Han Pengbo1，Jiang Feng2，Yao Yabo1，Han Gang1

Abstract Objective：To investigate the effects of Jiawei Shentong Zhuyu Decoction on osteoporosis model rats，and to observe its effects on biomechanics and bone metabolism.Methods：A total of 80 female Wistar rats were randomly divided into a blank group（10 rats）and a model group（70 rats）.All rats in model group received hysterectomy to simulate osteoporosis.60 successfully modeling rats were randomly divided into a placebo group，a control group，a low-dose group，a medium-dose group and a high-dose group，with 15 rats in each group.The rats in the traditional Chinese medicine group were given modified Shentong Zhuyu Decoction by gavage，with the high-dose group（1.32 g/mL），the medium-dose group（0.66 g/mL）and the low-dose group（0.33 g/mL），once a day for 3 weeks; the rats in the placebo group were given saline by gavage，10 mL/time，once a day for 3 weeks; the rats in the control group were given calcitonin injection，twice a week，for 3 weeks.After 3 weeks，bone biomechanical data，mineral density and trabecular structure of right tibia，serum osteocalcin and serum type I collagen telopeptide（PINP）were measured.Results：Compared with the blank group，the modulus of elasticity and the maximum load of the model group were decreased（P<0.05）.Compared with the placebo group，the modulus of elasticity and the maximum load of the control group and the traditional Chinese medicine group increased significantly（P<0.01）.With the increase of dose，the elastic modulus and maximum load of the rats in the traditional Chinese medicine group increased significantly（P<0.05）.2）Compared with the blank group，BMD，BV/TV，Tb.N and Tb.Th in the model group decreased（P<0.05）; BMD in the control group and the traditional Chinese medicine group increased significantly（P<0.01）; BMD in the middle-dose group and the high-dose group increased significantly（P<0.05）.3）Compared with the blank group，the serum BGP and P INP levels in the model group were significantly increased，and the difference was statistically significant（P<0.05）.Compared with the model group，the serum BGP and P INP in the traditional Chinese medicine group were significantly decreased.With the concentration of modified Shentong Zhuyu Decoction increasing，the trend of BGP and PINP declining was more obvious，and the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Jiawei Shentong Zhuyu Decoction can improve the biomechanical properties of bone and correct the degenerative changes of bone by reducing the content of BGP and PINP in serum of osteoporosis model rats，so as to achieve the goal of treating osteoporosis.

Key Words Osteoporosis; Modified Shentong Zhuyu Decoction; Bone mineral density; Biomechanics; Bone metabolism; Bone structure; BGP; PINP

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.018

骨質疏松是臨床常見全身性骨骼疾病，以骨量減少、骨強度減低為主要病理變化，導致骨質脆性增加易骨折，嚴重影響患者的日常生命質量[1-2]。微創手術雖可在一定程度緩解患者的臨床癥狀，但無法延緩病情的發展。骨質疏松屬于中醫學“痹證”“痛癥”等范疇，“肝腎不足、瘀血阻滯”是其主要病機，基于治病求本的原則我們認為“補益肝腎、活血化瘀止痛”是重要治則[3-4]。身痛逐瘀湯源自《醫林改錯注釋》，用于治療肩痛、臂痛、腰腿痛，或周身疼痛，經久不愈者。本團隊將身痛逐瘀湯大量運用于骨質疏松的治療，獲得了理想療效，這與國內外諸多文獻所報道一致[5-7]，但其作用機制目前尚未清楚。故我們利用骨質疏松模型鼠，對其進行身痛逐瘀湯干預，探討其可能的作用機制，具體如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選購80只6個月齡清潔級雌性wistar大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXX（滬）20070005，體質量（294±16）g。所有動物飼養于西安交通大學動物實驗中心，飼養條件：溫度（22±1.5）℃，濕度（50±1.5）%，12 h/12 h光暗周期。

1.1.2 藥物 加味身痛逐瘀湯由本院中藥研究院提供，中藥組成：秦艽12 g、羌活12 g、桃仁9 g、紅花9 g、當歸9 g、川芎9 g、沒藥9 g、五靈脂9 g、香附6 g、牛膝12 g、地龍9 g、甘草6 g、續斷9 g、狗脊9 g。按大鼠與人體間等效劑量換算將通竅止鼽湯分為高劑量（1.32 g/mL）、中劑量組（0.66 g/mL）、低劑量組（0.33 g/mL）。

1.1.3 試劑與儀器 10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，國藥準字H37022673）;臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：JI80-2B）;電子萬能材料試驗機（日本島津公司，型號：AUTO-GRAPH）;血清骨素鈣試劑盒[武漢明德生物有限公司，貨號：鄂食藥監械（準）字2014第2401995號]、PINP（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：ER7261）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 適應喂食2周后，禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛，按0.35 mL/100 g體質量腹腔注射麻醉，取俯臥位，以肋下1 cm，脊柱2 cm處為中心剪除長毛，常規消毒，背部切口，切口約1～2 cm，逐層分離脂肪、肌肉，用眼科剪探向腹腔深處靠大鼠身體外側，小心提出腹腔脂肪，輕輕翻查可見由脂肪組織包繞的梅花狀卵巢及緊密相連的輸卵管，用止血鉗夾住輸卵管結扎，剪去卵巢，止血后將拉出的脂肪組織送回腹腔內，將肌膜與肌層一起縫合，撒以青霉素粉，縫合皮膚，采取側臥式放回籠中，正常飲水。模型驗證：測量骨密度，再次進行疼痛行為檢測，并分別記錄熱痛覺行為，自發痛覺行為，機械痛覺行為檢測，證明骨質疏松疼痛模型建立。80只大鼠隨機分為空白組（10只）及造模組（70只），所有造模組大鼠接受切除子宮模擬骨質疏松模型，將60只造模成功大鼠（成功率85.71%）隨機分為安慰組、對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組15只。

1.2.2 干預方法 中藥組大鼠接受加味身痛逐瘀湯灌胃，高劑量組（1.32 g/mL）、中劑量組（0.66 g/mL）、低劑量組（0.33 g/mL），灌胃1次/d，連續灌胃3周;安慰組大鼠接受生理鹽水灌胃，10 mL/次，1次/d，連續灌胃3周;對照組大鼠給予降鈣素注射液注射，2次/周，連續注射3周。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠骨生物力學變化 干預后各組隨機選取3只大鼠，利用電子萬能材料試驗機對各組大鼠右側股骨進行三點彎曲試驗以檢測其生物力學性能，具體條件如下：兩端跨距20 mm，下壓速度5 mm/min，直至標本斷裂。同時取大鼠L5椎體進行壓縮試驗，計算出最大應力、抗壓強度和彈性模量。

1.3.2 右側脛骨骨礦物密度和骨小梁結構 干預后各組隨機選取3只大鼠，使用顯微CT（Micro CT）對各組大鼠左側脛骨近干骺端進行掃描，對脛骨近干骺端約1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm處進行三維重建，利用相應軟件對圖像進行處理后得出BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp數據。

1.3.3 血清骨鈣素、血清I型膠原氨基端肽原濃度變化 干預后各組隨機選取3只大鼠，取其腹主動脈血，充分離心后分離出上清液，采用ELISA檢測法進行BGP和PINP濃度測定，用碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至適量濃度后加至反應孔中加0.1 mL，4 ℃孵育過夜，后用PBS沖洗3次，2 min/次，隨后加入待測樣品，室溫下反應1 h，隨后用PBS沖洗3次，2 min/次，加入新鮮稀釋的酶標抗體，室溫下孵育1 h后洗滌。然后再于每個反應孔中加入TMB底物溶液0.1 mL，充分反應后加入2 mol/L的硫酸溶液0.05 mL顯色，在酶標儀中進行顯色測定，計算出OD值，操作過程嚴格按照說明書進行。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。所得數據都用均數±標準差（±s）來描述，組間秩和檢驗;組內比較采用配對t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠生物力學比較 與空白組比較，造模組大鼠彈性模量、最大載荷降低（P<0.05），與安慰組比較，對照組及中藥組彈性模量、最大載荷顯著升高（P<0.01）。隨著劑量的增加，中藥組大鼠彈性模量、最大載荷顯著增高（P<0.05）。見表1。

2.2 各組骨礦物密度和骨小梁結構比較 與空白組比較，造模組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低（P<0.05）;與安慰組比較，對照組及中藥組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著升高（P<0.01）;加味身痛逐瘀湯中劑量組和高劑量組大鼠上述指標較低劑量組增高（P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠BGP和PINP濃度變化 與空白組比較，造模組血清BGP和PINP均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與造模組比較，中藥組血清BGP和PINP均明顯降低，隨著加味身痛逐瘀湯濃度增加BGP和PINP下降的趨勢更明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

中醫古籍并無骨質疏松這一病名記載，其屬于“痛癥”“骨痿”“骨枯”等范疇，認為與腎及骨關系極為密切。腎乃先天之本，藏精主骨生髓。腎精充沛生化有源，則骨骼強壯，年老者腎精虧虛，致骨髓生化乏源，骨骼痿軟無力[8]。此外，元氣虧虛致血液運行無力，因虛致瘀，脈絡瘀滯不暢，脈道內氣血不足必引發瘀血形成，阻滯水谷精微等物質布散，骨髓也因此不得充潤而出現骨痛、骨折等臨床癥狀，即骨質疏松癥[9-11]。正如《醫林改錯》中曰：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”;《靈樞》中也認為：“老者之氣血衰，其肌肉枯，氣道澀”。認為腎虛及血瘀是骨質疏松發生發展重要原因，基于此，王清任提出從“氣血”著手治療骨質疏松癥，正如其提出“諸痹癥疼痛”，從而提出了身痛逐瘀湯這一經典名方。方中桃仁、紅花、當歸、川芎有活血化瘀之功，秦艽、羌活可祛風濕除痹通，五靈脂和香附是行氣止痛的要藥，牛膝及地龍則可通利關節，此外，當歸亦是活血補血之藥，而牛膝及甘草還有補益之性;基于“肝腎同源”，本方加續斷及狗脊以補肝腎，續筋骨，調血脈，整方共奏補益肝腎、活血化瘀之功[11-12]。

本研究為進一步探析加味身痛逐瘀湯的作用機制，測試了各組大鼠右股骨及L5的生物力學指標，生物力學是體現骨組織對外界作用下的生物學效應，是評價骨組織抗骨折能力的重要方法[13-14]。本研究結果顯示空白組大鼠右股骨及L5的彈性模量、最大載荷均明顯高于造模組大鼠，這說明骨質疏松大鼠的生物力學效應的確產生了明顯的改變，而通過一定干預措施后大鼠抗骨折能力明顯提高，其中加味身痛逐瘀湯較降鈣素更可改善骨質疏松大鼠的生物力學能力，并隨著劑量的增加，中藥組大鼠彈性模量、最大載荷顯著增高（P<0.05）。在本研究中我們利用Micro CT對各組大鼠左脛骨的骨礦物密度和骨小梁結構進行觀察，結果顯示造模后大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低，其中加味身痛逐瘀湯較降鈣素更可改善骨質疏松大鼠礦物密度和骨小梁結構，并隨著劑量的增加上述指標改善更為明顯。這說明加味身痛逐瘀湯使骨組織衰退結構得到改善，降低骨脆性，降低骨折風險。

在對作用機制的研究中我們檢測了各組大鼠骨鈣素及PINP濃度的變化，結果顯示造模后骨鈣素及PINP濃度明顯升高。BGP由成骨細胞合成及分泌，是骨組織維持正常礦化速度的關鍵，是反映成骨細胞活性程度及骨代謝水平的重要因子。有研究[15-16]認為隨著機體雌激素的減少，其抑制破骨細胞活性的能力被削弱，隨之導致骨吸收增加，進而形成高轉換率型骨質疏松，其中BGP表達明顯上調是高轉換率型骨質疏松的生化指征。此外，隨著骨轉換率增加機體PINP表達亦明顯上調，集體大部分骨基質由1型膠原質形成，Ⅰ型原骨膠原有羧基和氨基延長端，一個膠原分子的合成可產生一個分子的PINP，是體現骨骼代謝的重要標志物[17，18]。故下調BGP及PINP濃度是改善骨質疏松的重要途徑。本研究顯示與對照組比較，中藥組血清BGP和PINP均明顯降低，隨著加味身痛逐瘀湯濃度增加BGP及PINP下降的趨勢更明顯，差異有統計學意義（P<0.05），故加味身痛逐瘀湯可以通過抑制BGP及PINP的表達而發揮抑制骨的高轉化狀態的作用，從而改善骨質疏松癥。

綜上所述，加味身痛逐瘀湯可能通過降低骨質疏松模型大鼠血清BGP和PINP含量，提高骨生物力學性能，糾正骨退行性改變，實現治療骨質疏松的目的。

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（2019-02-25收稿 責任編輯：王明）

基金項目：2017陜西自然科學基礎研究計劃項目（2017JM8146）作者簡介：韓鵬勃（1979.03—），男，研究生，副主任醫師，研究方向：骨質疏松及頸肩腰腿痛，E-mail：asdvserd@163.com通信作者：蔣鋒（1983.11—），男，研究生，副主任醫師，研究方向：骨性關節炎的臨床與基礎研究，E-mail：ccjfeng@163.com