苦參堿聯合化療藥物對人急性髓系白血病HL-60細胞增殖及侵襲力的影響

晁榮 胡曉燕 朱生東 鄧偉 王莉

摘要 目的：探究苦參堿聯合化療藥物對人急性髓系白血病HL-60細胞增殖及侵襲力的影響。方法：體外培養人急性髓系白血病HL-60細胞，苦參堿單藥組以1.0 g/L苦參堿干預，三氧化二砷單藥組以3 μmol/L三氧化二砷處理，聯合組以終濃度為1.0 g/L的苦參堿+3 μmol/L三氧化二砷處理，空白組以等量生理鹽水處理。MTT法檢測HL-60細胞增殖情況，ranswell小室實驗檢測HL-60侵襲力，蛋白免疫印跡法檢測HL-60細胞MMPs蛋白表達情況。結果：苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組、聯合組24 h PIR分別為（18.54±2.54）%，（29.54±2.62）%，（41.45±3.72）%，48 h PIR分別為（27.46±2.55）%，（38.93±3.76）%，（45.64±3.54）%，3組內HL-60的PIR均隨著培養時間的增加而增加，其中聯合組24 h、48 h PIR均高于同時間點的苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組，差異有統計學意義（P<0.05）。空白組、苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組、聯合組侵襲細胞分別為（127.64±23.93）個、（94.24±15.23）個、（81.23±12.21）個、（75.13±10.69）個，相對侵襲指數分別為（100.00±0.00）%、（73.44±0.34）%、（62.47±0.15）%、（58.54±0.36）%;MMP-2蛋白相對表達量分別為（0.91±0.05）、（0.39±0.04）、（0.23±0.04）、（0.14±0.03）;MMP-9蛋白相對表達量分別為（0.62±0.05）、（0.31±0.05）、（0.27±0.04）、（0.16±0.02）。與空白組比較，苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組、聯合組侵襲細胞數量顯著減少，相對侵襲指數及細胞中MMP-2、MMP-9相對表達量降低，且聯合組均低于苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：苦參堿聯合三氧化二砷通過下調MMP-2、MMP-9蛋白表達有效抑制人急性髓系白血病HL-60細胞增殖及侵襲。

關鍵詞 人急性髓系白血病;HL-60細胞;凋亡;苦參堿;表達;機制

Effects of Matrine Combined with Chemotherapeutic Drugs on Proliferation and Invasion of Human Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells

Chao Rong，Hu Xiaoyan，Zhu Shengdong，Deng Wei，Wang Li

Abstract Objective：To investigate the effects of matrine combined with chemotherapeutic drugs on the proliferation and invasion of human acute myeloid leukemia HL-60 cells.Methods：Human acute myeloid leukemia HL-60 cells were cultured in vitro.Matrine monotherapy group was treated with 1.0 g/L matrine，arsenic trioxide monotherapy group with 3 mmol/L arsenic trioxide，combination group with 1.0 g/L matrine+3 mmol/L arsenic trioxide，blank group with the same amount of saline.MTT assay was used to detect the proliferation of HL-60 cells，ranswell chamber assay was used to detect the invasion ability of HL-60 cells，and Western blotting was used to detect the expression of MMPs in HL-60 cells.Results：The 24-hour PIR of matrine group，arsenic trioxide group and combination group were（18.54±2.54）%，（29.54±2.62）%，（41.45±3.72）% and 48-hour PIR were（27.46±2.55）%，（38.93±3.76）%，（45.64±3.54）%.The PIR of HL-60 in the 3 groups increased with the increase of culture time.PIR of 24 h and 48 h in THE combination group was higher than that of matrine and arsenic trioxide at the same time point（P<0.05）.The number of invasive cells in the blank group，the matrine group，the arsenic trioxide group and the combination group were（127.64±23.93），（94.24±15.23），（81.23±12.21），（75.13±10.69），and the relative invasion index were（100.00±0.00），（73.44±0.34），（62.47±0.15），（58.54±0.36）%，respectively.The relative expressions of MMP-2 were （0.91±0.05），（0.39±0.04），（0.23±0.04），（0.14±0.03），and the MMP-9 protein were （0.62±0.05），（0.31±0.05），（0.27±0.04），（0.16±0.02），respectively.Compared with the blank group，the number of invasive cells in matrine monotherapy group，arsenic trioxide monotherapy group and combination group decreased significantly，the relative invasion index and the relative expression of MMP-2 and MMP-9 protein in cells decreased，and the combined group was lower than matrine monotherapy group and arsenic trioxide monotherapy group（P<0.05）.Conclusion：Matrine combined with arsenic trioxide can effectively inhibit the proliferation and invasion of human acute myeloid leukemia HL-60 cells，and its mechanism may be related to the down-regulation of MMP-2 and MMP-9 protein expression.

Key Words Human acute myeloid leukemia; HL-60 cells; Apoptosis; Matrine; Expression; Mechanisms

中圖分類號：R284;R552文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.019

白血病是血液系統惡性腫瘤，與造血干細胞增殖失控、分化成熟受阻、正常程序凋亡失調等有關，目前化療仍是其主要治療手段，但由于化療不良反應較大，治療效果不佳，因此急需尋求更為安全有效的治療方案[1-2]。近年來從傳統中草藥中開發高效低毒的抗腫瘤活性成分已成為人們關注的焦點[3]。苦參堿（苦參啶-15-酮）提取自豆科植物苦參（Sophora flavescens）的干燥根中，具有抗炎、抗病毒、強心、抗肝損傷、抗肝纖維化及抗腫瘤等多種生物活性，近年來有關苦參堿的抗腫瘤作用方面的研究日漸增多，但有關其抗腫瘤機制尚未完全闡明[4-5]。本研究體外培養人急性髓系白血病HL-60細胞，觀察苦參堿對細胞增殖、細胞凋亡及侵襲的影響，并探討作用機制，為苦參堿在臨床應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人急性髓系白血病HL-60細胞，購于中國醫學院科學院血液學研究所。

1.1.2 藥物 苦參堿注射液（陜西昂盛生物醫藥科技有限公司，生產批號：110805-200306）;純度≥98%;注射用三氧化二砷（北京雙鷺藥業有限公司產品，國藥準字H20080665）。

1.1.3 試劑與儀器 RPMI-1640培養基及0.25%胰蛋白酶（美國HyClone公司）;二甲基亞砜、四甲基偶氮唑鹽（美國Sigma公司）;基質金屬蛋白酶-2、9（MMP-2、MMP-9）多克隆抗體（英國Abcam公司）等。HERAcell 150i型CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司）;MK3型全自動酶標儀（美國Thermo Fisher公司）;LXJ-II型超低溫高速離心機（上海領成生物科技有限公司）;JY-ZY3型蛋白凝膠電泳轉印系統（美國Bio-Rad公司）;JYH27020型電泳儀、Gel doc 2000凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組

將HL-60細胞以含10%胎牛血清的1640培養基，置于恒溫培養箱中培養（37 ℃，5%CO2飽和濕度），待細胞形態良好，且處于生長對數期時進行實驗研究。實驗分為空白組、苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組和聯合組。

1.2.2 干預方法

取生長至對數期形態較好的HL-60細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL，接種于96孔板，苦參堿單藥組以1.0 g/L苦參堿干預，三氧化二砷單藥組以3 μmol/L三氧化二砷處理，聯合組以終濃度為1.0 g/L的苦參堿+3 μmol/L三氧化二砷處理，空白組以等量生理鹽水處理。

1.2.3 檢測指標與方法

MTT法[6]檢測HL-60細胞增殖情況：空白組、苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組和聯合組HL-60細胞培養經1.2.2方法干預24、48 h后，棄去每孔上清液，加20 μL 5 mg/mL MTT溶液檢測細胞增殖情況，采用酶標儀檢測各孔吸光光度值（A490 nm），計算各組HL-60增殖抑制率（PIR）=（空白組A490 nm-實驗組A490 nm）/空白組A490 nm×100%。

Transwell小室實驗檢測HL-60細胞侵襲力：參照相關文獻[7]檢測HL-60細胞侵襲力，HE染色后于光學倒置顯微鏡下觀察并拍照，計數侵襲細胞數量，相對侵襲指數=干預組侵襲細胞數/空白組侵襲細胞數×100%。

蛋白免疫印跡法（WB）[8]檢測HL-60細胞MMPs蛋白表達情況：空白組、苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組和聯合組經不同藥物處理48 h后，收集細胞，提取細胞總蛋白，參照BCA試劑盒檢測蛋白濃度。經10%分離膠及5%濃縮膠行SDS-PAGE，轉膜，孵育抗體，最后于暗室中以ELC發光試劑盒顯影，以GADPH為參照，采用Bio-Rad凝膠成像系統分析各組MMP-2/MMP-9蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 苦參堿聯合化療藥物對HL-60細胞增殖的影響

苦參堿、三氧化二砷及聯合用藥均可抑制HL-60細胞增殖，3組內HL-60的PIR均隨著培養時間的增加而增加，其中聯合組24 h、48 h PIR均高于同時間點的苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 苦參堿聯合化療藥物對HL-60細胞侵襲力的影響

與空白組比較，苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組、聯合組侵襲細胞數量顯著減少，相對侵襲指數降低，且聯合組侵襲細胞數量及相對侵襲指數顯著低于苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 苦參堿聯合化療藥物對HL-60細胞MMP-2/MMP-9蛋白表達比較

空白組、苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組、聯合組MMP-2蛋白相對表達量分別為（0.91±0.05）、（0.39±0.04）、（0.23±0.04）、（0.14±0.03）;MMP-9蛋白相對表達量分別為（0.62±0.05）、（0.31±0.05）、（0.27±0.04）、（0.16±0.02）。與空白組比較，苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組、聯合組MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量顯著降低，且聯合組MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量低于苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡（WB）法檢測苦參堿聯合化療藥物 對HL-60細胞MMP-2/MMP-9蛋白表達的影響 注：A：空白組;B：苦參堿單藥組;C：三氧化二砷單藥組;D：聯合組

3 討論

白血病是一種嚴重危害人類健康的血液系統惡性腫瘤，其發病機制與腫瘤細胞增殖失控、凋亡抵抗效應相關，導致腫瘤形成[9-10]。三氧化二砷作為一種有毒性的藥物古代即用于治療多種疾病，我國于20世紀70年代用于急性早幼粒細胞白血病的治療，并已被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準作為急性早幼粒細胞白血病的一線治療藥物。三氧化二砷與其他藥物無交叉耐藥反應，主要通過誘導腫瘤細胞凋亡抑制腫瘤細胞的增殖，廣泛用于淋巴瘤、多發性骨髓瘤及骨髓增生異常綜合征等疾病的治療中，近年來也逐漸用于治療肝癌、膽囊癌、乳腺癌、神經母細胞瘤等惡性腫瘤;但應用中發現心臟毒性，肝臟毒性，胃腸道反應等不良反應大，因此探討更佳的治療方案，以降低三氧化二砷應用劑量及其不良反應是臨床目前研究的熱點[11]。

苦參是豆科植物苦參的干燥根，別名為苦骨、牛參等，始載于《神農本草經》，列為中品。在梁代陶弘景的《本草經集注》中對苦參的原植物形態和分布進行了初步描述。明代李時珍在《本草綱目》曰：苦以味名，參以功名?？鄥⑿院犊?，歸心、肝、胃、大腸和膀胱經;屬于清熱燥濕藥，具有清熱燥濕，殺蟲，利尿的功效;用于便血，熱痢，濕疹，濕瘡，黃疸尿閉，陰腫陰癢，赤白帶下等病癥的治療[12-13]。苦參有效成分苦參堿具有廣泛藥理活性，研究報道，其抗腫瘤作用顯著，可有效抑制腫瘤血管新生、抑制腫瘤細胞生長轉移、誘導腫瘤細胞分化凋亡等[14-16];苦參堿可通過顯著下調肝癌細胞表皮生長因子受體表達而發揮抗腫瘤作用;通過下調B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白表達，上調Fas/FasL及Bcl-2相關X（Bax）蛋白表達，同時還可通過活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、8（Caspase3、Caspase8）達到抑制骨肉瘤細胞增殖，誘導其凋亡。細胞無限增殖是惡性腫瘤細胞的重要生長特性之一，因此有效抑制腫瘤細胞生長是重要的抗腫瘤機制，也是抗腫瘤藥物篩選的重要指標和途徑。本研究中選取1.0 g/L的苦參堿聯合3 μmol/L三氧化二砷干預HL-60細胞，并與苦參堿、三氧化二砷單獨用藥進行比較，結果顯示，3組內HL-60的PIR均隨著培養時間的增加而增加，其中聯合組24 h、48 h PIR均高于同時間點的苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組。提示苦參堿聯合三氧化二砷對HL-60細胞增殖的抑制作用更強，優于單獨用藥。

腫瘤細胞侵襲及轉移是一個復雜的過程，與腫瘤細胞及宿主微環境間的相互作用密切相關[17-18]。MMPs是參與細胞外基質和基底膜降解的蛋白水解酶，MMP-2及MMP-9是MMPs家族中唯一可以降解Ⅳ型膠原的明膠酶類，MMP-2與MMPs結構上具有較大同源性，在腫瘤侵襲、轉移過程中起關鍵作用，MMP-2的過度表達在多種腫瘤組織中均可檢測出來，MMP-9可通過破壞基質降解平衡，促使癌細胞穿越組織學屏障，促進腫瘤細胞侵襲其鄰近周圍組織及向遠處正常組織轉移[19-20]。周劍等[21]研究顯示，苦參堿通過降低COX-2的蛋白和mRNA表達來抑制神經膠質瘤U87細胞的增殖和侵襲。李金州等[22]的一項關于結腸癌體外實驗研究結果顯示，苦參堿可抑制結腸癌SW480和SW480/M5細胞的增殖和遷移侵襲力，可能與抑制AKT/GSK3β/β-catenin信號通路有關。本研究結果中，與空白組比較，苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組、聯合組侵襲細胞數量顯著減少，相對侵襲指數降低，且聯合組侵襲細胞數量及相對侵襲指數顯著低于苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組。WB檢測可見，與空白組比較，苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組、聯合組MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量顯著降低，且聯合組MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量低于苦參堿單藥組、三氧化二砷單藥組。表明苦參堿聯合三氧化二砷可有效抑制HL-60細胞發生侵襲，可能與下調MMP-2、MMP-9蛋白表達。

綜上所述，苦參堿聯合三氧化二砷可有效抑制人急性髓系白血病HL-60細胞增殖及侵襲，其作用機制與顯著下調MMP-2、MMP-9蛋白表達，但有關其最佳應用劑量及其他促HL-60凋亡作用機制仍需進一步系統研究。

參考文獻

[1]林鵬，姚海英，周伯良，等.IDA聯合Ara-C治療初發急性髓系白血病對血清sICAM-1、sVCAM-1以及淋巴細胞亞群的影響[J].貴州醫藥，2018，42（5）：533-536.

[2]齊興菊，吳昌學.康復新液治療兒童急性淋巴細胞白血病化療性口腔潰瘍的臨床療效[J].貴州醫科大學學報，2017，42（10）：1176-1178，1195.

[3]朱文赫，陳麗紅，許娜，等.雙氫青蒿素誘導人肝癌細胞SMMC-7721凋亡及其分子機制研究[J].中國藥學雜志，2018，53（3）：187-192.

[4]張明發，沈雅琴.苦參堿類生物堿的毒性研究進展[J].藥物評價研究，2018，41（4）：682-691.

[5]王珂欣，高麗，周玉枝，等.苦參堿抗肝癌細胞增殖的1H-NMR代謝組學研究[J].中草藥，2017，48（20）：4275-4283.

[6]高平章，韓旭花，白賽賽，等.漢黃芩素抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路影響急性白血病HL-60細胞增殖[J].泉州師范學院學報，2017，35（6）：1-5.

[7]馮品，姚青林，王曉光，等.三氧化二砷通過線粒體途徑誘導人白血病HL-60細胞凋亡[J].現代生物醫學進展，2017，17（24）：4621-4625.

[8]魏婧昕，丁蘭，劉揚，等.Rabdosin B對急性早幼粒白血病細胞HL-60分化的誘導作用[J].中草藥，2018，49（11）：2591-2600.

[9]Farge T，Saland E，de Toni F，et al.Chemotherapy-Resistant Human Acute Myeloid Leukemia Cells Are Not Enriched for Leukemic Stem Cells but Require Oxidative Metabolism[J].Cancer Discov，2017，7（7）：716-735.

[10]Brenner AK，Nepstad I，Bruserud .Mesenchymal Stem Cells Support Survival and Proliferation of Primary Human Acute Myeloid Leukemia Cells through Heterogeneous Molecular Mechanisms[J].Front Immunol，2017，8：106.

[11]葉永斌，許曉軍，陳艷紅，等.三氧化二砷聯合阿克拉霉素對急性髓系白血病KG-1a細胞的協同殺傷效應[J].中華腫瘤雜志，2017，39（4）：256-262.

[12]張明發，沈雅琴.苦參堿類生物堿的鎮痛作用研究進展[J].藥物評價研究，2018，41（5）：904-911.

[13]盧迎宏，王丹，井海云.苦參堿對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞炎癥反應及增殖凋亡的影響及分子機制研究[J].中國免疫學雜志，2018，34（4）：537-543.

[14]劉晶晶，牟艷玲.苦參堿抗腫瘤作用機制的研究進展[J].中國藥房，2017，28（19）：2707-2711.

[15]王珂欣，高麗，周玉枝，等.苦參堿抗肝癌細胞增殖的1H-NMR代謝組學研究[J].中草藥，2017，48（20）：4275-4283.

[16]李國慧，劉瑞花，李貴霞，等.苦參堿抑制人骨肉瘤細胞MG63增殖的實驗研究[J].河北醫科大學學報，2014，35（2）：162-165.

[17]Díaz-Valdivia N I，Calderón C C，Díaz J E，et al.Anti-neoplastic drugs increase caveolin-1-dependent migration，invasion and metastasis of cancer cells：[J].Oncotarget，2017，8（67）：111943-111965.

[18]Kwak T，Drews-Elger K，Ergonul A，et al.Targeting of RAGE-ligand signaling impairs breast cancer cell invasion and metastasis[J].Oncogene，2017，36（11）：1559-1572.

[19]Shen KH，Hung JH，Chang CW，et al.Solasodine inhibits invasion of human lung cancer cell through downregulation of miR-21 and MMPs expression[J].Chem Biol Interact，2017，268：129-135.

[20]Zou S，Yang J，Guo J，et al.RAD18 promotes the migration and invasion of esophageal squamous cell cancer via the JNK-MMPs pathway[J].Cancer Lett，2018，417：65-74.

[21]周劍，曹愛玲，舒誠榮.苦參堿對神經膠質瘤U87細胞增殖和侵襲的抑制作用研究[J].現代藥物與臨床，2017，32（7）：1184-1187.

（2019-09-05收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：甘肅省自然科學基金項目（2018-0405-JCC-0846）作者信息：晁榮（1987.03—），女，碩士，主治醫師，研究方向：兒童血液腫瘤，E-mail：442935042@qq.com