阿德福韋衍生物灌胃給藥后的代謝產物阿德福韋在大鼠體內的藥動學研究

肖濤 楊洋 李韜 李靜 傅曉鐘 吳帝容 王洋 肖紅

摘 要 目的：建立阿德福韋（PMEA）的含量測定方法，并研究阿德福韋衍生物[阿德福韋前藥，阿德福韋-熊去氧膽酸-3-丙基酯，L-亮氨酸-3-丙基酯（PMEA-1c）]灌胃給藥后的代謝產物PMEA在大鼠體內的藥動學。方法：采用高效液相色譜-串聯質譜（HPLC- MS/MS）法。色譜柱為BEH C18，流動相為0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水（梯度洗脫），流速為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為1 μL；檢測離子對為PMEA質荷比（m/z）274.1→162.1，葛根素（內標）m/z 417.1→267.1。12只大鼠隨機分為阿德福韋酯（ADV）組（陽性對照，90 mg/kg）、PMEA-1c組（160 mg/kg），每組6只，分別灌胃給予相應藥物1次，于給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h尾靜脈取血測定PMEA血藥濃度；利用DAS 2.0軟件計算相關藥動學參數。結果：PMEA檢測質量濃度線性范圍為6.1～440.0 ng/mL（r=0.998 5），日內、日間精密度和穩定性試驗的RSD均<10%（n=3、5、6），準確度為82.16%～97.33%（RSD≤6.4%， n=5），基質效應為95.96%～106.35%（RSD≤4.9%， n=5）；ADV組和PMEA-1c組大鼠血漿中PMEA的t1/2分別為（1.762±0.117）、（2.548±0.174） h，AUC0-24 h分別為（2 170.059±146.091）、（4 704.257±176.792） μg·h/L，cmax分別為（613.092±9.504）、（697.295±15.275） μg /L；與ADV組比較，PMEA-1c組大鼠t1/2、AUC0-24 h、AUC0-∞、cmax均顯著增加（P<0.01或P<0.001）。結論：建立的方法準確可靠，本實驗結果表明PMEA-1c代謝為單室模型，其可作為阿德福韋前藥的潛力藥物，為阿德福韋前藥的繼續研究奠定了基礎。

關鍵詞 阿德福韋；阿德福韋衍生物；高效液相色譜-串聯質譜；藥動學

Study on Pharmacokinetics of Metabolites of Adefovir in Rats after Intragastric Administration of Adefovir Derivatives

XIAO Tao1，2，YANG Yang1，2，LI Tao1，2，LI Jing1，2，FU Xiaozhong2，WU Dirong2，WANG Yang2，XIAO Hong2（1.Key Lab of Pharmaceutics of Guizhou Provience， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China；2.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM， School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of adefovir （PMEA） and study the pharmacokinetics of metabolites PMEA in rats after intragastric administration of PMEA derivatives [PMEA prodrug， adefovir-ursodeoxycholic acid-3-propyl ester， L-leucine-3-propyl ester （PMEA-1c）] in rats. METHODS： HPLC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid acetonitrile-0.1% formic acid water （gradient elution） at the flow rate of 0.25 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 1 μL. The quantitative ions were PMEA m/z 274.1→162.1， puerarin （internal standard） m/z 417.1→267.1. 12 rats were randomly divided into adefovir dipivoxil （ADV） group （positive control， 90 mg/kg） and PMEA-1c group （160 mg/kg）， with 6 rats in each group. They were given relevant medicine once intragstrically， and the blood samples were collected from tail vein 0.083， 0.25， 0.5， 0.75， 1， 2， 4， 6， 8， 10， 12， 24 h after administration to determine the plasma concentration of PMEA. Relevant pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS 2.0 software. RESULTS： The linear range of PMEA was 6.1-440.0 ng/mL （r=0.998 5）. RSDs of intra and inter day of precision and stability tests were all less than 10% （n=3， 5， 6）， and the accuracy was 82.16%-97.33% （RSD≤6.4%， n=5）. Matrix effects ranged from 95.96%-106.35% （RSD≤4.9%， n=5）. The pharmacokinetic parameters of PMEA in ADV group and PMEA-1c group were as follows as t1/2 were （1.762±0.117） and （2.548±0.174） h； AUC0-24 h were （2 170.059±146.091） and （4 704.257±176.792） μg·h/L； cmax were （613.092±9.504） and （697.295±15.275） μg/L， respectively. Compared with ADV group， t1/2， AUC0-24 h， AUC0-∞ and cmax of rats in PMEA-1c group were increased significantly （P<0.01 or P<0.001）. CONCLUSIONS： Established method is accurate and reliable. The trial indicates that PMEA-1c metabolism is single compartment model， show that can be used as a potential prodrug for adefovir， which lay a foundation for the further study of adefovir prodrug.

KEYWORDS Adefovir；Adefovir derivative； HPLC-MS/MS； Pharmacokinetics

阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil，ADV）是美國FDA在2002年批準上市的由Gilead Science公司研制的第一個非環核苷膦酸酯類抗乙型肝炎病毒（HBV）藥物，是阿德福韋（PMEA）的親脂性口服前藥，口服后在非特異性酯酶水解作用下迅速轉化為活性PMEA而發揮藥效，ADV具有較好的抗HBV活性，并且對拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋、泛昔洛韋以及恩曲他濱等核苷類似物產生耐藥的變異HBV也能產生較好的抑制效果[1-5]，但是ADV在臨床應用中發現其存在劑量依賴性和腎毒性，引起腎性糖尿及蛋白尿等[6-7]。

為了尋找更優的PMEA前藥，貴州醫科大學藥學院藥物化學課題組前期通過在PMEA結構中引入L-氨基酸和膽酸結構合成了一系列PMEA單L-氨基酸酯及單膽酸酯衍生物，利用內源性的膽汁酸和L-氨基酸增加主動轉運提高藥物吸收，實現藥物的肝靶向富集，提高抗病毒活性，同時降低PMEA前藥的毒副作用[8-9]。抗病毒活性研究和原代肝細胞攝取研究結果表明[10]，PMEA單L-氨基酸酯及單膽酸酯衍生物對HBV-DNA復制的抑制效果和大鼠原代肝細胞攝取能力顯著提高，其中阿德福韋-熊去氧膽酸-3-丙基酯，L-亮氨酸-3-丙基酯（PMEA- 1c）的抗病毒活性較強。因此，筆者在前期實驗結果的基礎上，對PMEA-1c在大鼠體內的藥動學進行研究，以期為PMEA衍生物的后續研究及臨床應用提供實驗基礎。PMEA-1c結構式見圖1。

1 材料

1.1 儀器

QTRAP-5500高效液相色譜-串聯質譜儀（美國AB SCIEX公司）；Allegra 64R臺式冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；AE240萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；HT-8000高純氮氣機（上海奧突斯工貿有限公司）

1.2 藥品與試劑

PMEA-1c（貴州醫科大學藥學院傅曉鐘課題組合成，批號：201804，純度：≥98%）；PMEA對照品（批號：FG260083，純度：≥98%）、阿德福韋酯對照品（批號：CC310105，純度：≥98%）均購自薩恩化學技術有限公司；葛根素對照品（內標，中國食品藥品檢定研究院，批號：0752-9605，純度：≥98%），甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純。

1.3 動物

健康SD大鼠，♂，體質量180～220 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（黔）2018-0001。動物于（22±2） ℃飼養，飼養管理均嚴格按照實驗動物的要求及規則，實驗前飼養1周適應環境。本實驗經貴州醫科大學實驗動物倫理委員會批準，批準編號為1801220，實驗前12 h禁食，自由飲水。

2 方法與結果

2.1 PMEA血藥濃度測定

2.1.1 色譜與質譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：BEH C18（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～1 min，5%A；1～7 min，5%→95%A；7～8 min，95%A，8～9 min，95%→5%A ）；流速：0.25 mL/min；進樣量：1 μL。

（2）質譜條件。采用電噴霧電離源（ESI），檢測方式為多反應離子監測（MRM），掃描模式為正離子模式；PMEA檢測離子對質荷比（m/z）為274.1→162.1，碰撞電壓為35 V；葛根素m/z 為417.1→267.1，碰撞電壓為46 V；毛細管電離電壓為5 500 V，去溶劑溫度為550 ℃，氣體流速為9 L/min，氣體壓強為40 psi。

2.1.2 溶液的制備

（1）PMEA對照品溶液的制備。精密稱定2.26 mg PMEA對照品于10 mL量瓶中，甲醇溶解定容，混勻，得質量濃度為226.00 μg/mL的PMEA對照品貯備液。取390 μL貯備液于2 mL量瓶，甲醇定容，即得質量濃度為44 μg/mL的PMEA對照品溶液。

（2）葛根素溶液的制備。精密稱定2.5 mg葛根素對照品于25 mL量瓶，甲醇溶解定容，混勻，得質量濃度為0.1 mg/mL的葛根素貯備液。取適量貯備液于量瓶，甲醇定容，即得質量濃度為10.00 ng/mL葛根素溶液。

2.1.3 血漿樣品的處理方法

取血漿樣品100 μL于1.5 mL離心管中，加入400 μL含內標甲醇溶液，渦旋1 min，超聲（功率：250 W，頻率：80 kHz，下同）5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液用氮氣吹干。100 μL初始流動相復溶，渦旋1 min，超聲5 min，10 000 r/min離心10 min，取適量上清液，按“2.1.1”項下色譜與質譜條件進樣測定。

2.1.4 方法學考察

（1）專屬性的考察。取空白血漿（不加內標）、PMEA對照品溶液、空白血漿+PMEA、灌胃給藥2 h后的大鼠血漿樣品，按“2.1.3”項下方法處理后，按“2.1.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，PMEA和內標能被同時檢測，互不干擾，峰形良好，且血漿中內源性物質不干擾其測定，基線平穩，保留時間分別為1.06、5.61 min。樣品總離子流圖見圖2。

（2）線性關系及定量下限考察。取“2.1.2”項下PMEA對照品溶液適量，稀釋成質量濃度為440.0、220.0、110.0、36.6、12.2、6.1 ng/mL的系列溶液。取大鼠空白血漿100 μL，加入上述系列溶液100 μL，按“2.1.3”項下血漿樣品處理方法操作后，按“2.1.1”項下色譜與質譜條件進樣測定。以PMEA峰面積與內標峰面積之比為縱坐標（y），PMEA質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，得到PMEA的回歸方程為y=0.000 6x-0.010 5（r=0.998 5），檢測質量濃度線性范圍為6.1～440.0 ng/mL，定量下限為6.1 ng/mL。

（3）精密度試驗。取大鼠空白血漿100 μL，加入“2.1.4（2）”項下高（440.0 ng/mL）、中（36.6 ng/mL）、低（6.1 ng/mL）3個質量濃度的PMEA溶液100 μL，按“2.1.3”項下血漿樣品處理方法操作，每個濃度平行6份，按“2.1.1”項下色譜與質譜條件進樣測定。3個質量濃度樣品同日內連續進樣6次，考察日內精密度；另外連續進樣測定3 d，考察日間精密度。結果，PMEA日內RSD均≤6.8%（n=6），日間RSD均≤9.9%（n=3），表明儀器精密度良好。

（4）穩定性試驗。取大鼠空白血漿100 μL，加入“2.1.4（2）”項下高（440.0 ng/mL）、中（36.6 ng/mL）、低（6.1 ng/mL）3個質量濃度的PMEA溶液100 μL，每個濃度平行5份，按“2.1.3”項下血漿樣品處理后室溫放置6 h后，按“2.1.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，以考察血漿樣品中PMEA室溫下放置6 h的穩定性；再同法制備低、中、高3個質量濃度血漿樣品，每個濃度平行3份，于-20 ℃下反復凍融3次，按“2.1.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，以考察血漿樣品中PMEA在反復凍融條件下的穩定性。結果，血漿樣品中PMEA于室溫下放置6 h后PMEA峰面積的RSD均≤6.3% （n=5）；經-20 ℃下反復凍融3次后PMEA峰面積RSD均≤7.0%（n=3）。

（5）準確度及基質效應考察。取大鼠空白血漿100 μL，按“2.1.3”項下血漿樣品處理方法操作后，加入“2.1.4（2）”項下高（440.0 ng/mL）、中（36.6 ng/mL）、低（6.1 ng/mL）3個質量濃度的PMEA溶液100 μL，每個濃度平行5份，按“2.1.3”項下血漿樣品處理方法得A樣品，按“2.1.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積A；另取空白血漿100 μL，除不加內標外，按“2.1.3”項下血漿樣品處理方法處理，再向獲得的上清液中加入高（440.00 ng/mL）、中（36.60 ng/mL）、低（6.10 ng/mL）3個質量濃度的混合PMEA溶液和內標溶液100 μL，氮氣吹干，殘留物以150 μL初始流動相溶解得B樣品，按“2.1.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積B；另取上述高（440.0 ng/mL）、中（36.6 ng/mL）、低（6.1 ng/mL）3個質量濃度的混合PMEA溶液與內標100 μL，氮氣吹干，殘留物以150 μL初始流動相溶解得C樣品，按“2.1.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積C。準確度計算方法為峰面積B與峰面積A之比，基質效應計算方法為峰面積B與峰面積C之比。結果，準確度為82.16%～97.33%（RSD≤6.4%，n=5）；基質效應為 95.96%～106.35%（RSD≤4.9%，n=5）。

2.2 藥動學研究

取大鼠12只，隨機分為ADV組（陽性對照，90 mg/kg）、PMEA-1c組（160 mg/kg），2組給藥劑量均根據0.183 mmol/kg PMEA換算而得，每組6只，每日灌胃給藥1次。分別于給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h尾靜脈采集約0. 3 mL血液置于涂有肝素的EP管中，6 000 r/min離心10 min，收集上清液。取血漿樣品100 μL于1.5 mL離心管中，按“2.1.3”項下血漿樣品處理方法處理，按“2.1.1”項下色譜與質譜條件下進樣測定，計算血漿中PMEA血藥濃度，再利用DAS 2.0軟件擬合計算相關藥動學參數，結果以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。ADV和PMEA-1c灌胃給藥后PMEA藥-時曲線見圖3，主要藥動學參數見表1。

結果表明，PMEA -1c灌胃給藥后釋放的PMEA的藥-時曲線特征符合血管外給藥單室模型。與ADV組比較，PMEA-1c組t1/2、AUC0-24 h、AUC0-∞、cmax均顯著增加（P<0.01或P<0.001），VRT0-24 h、CLz/F顯著減少（P<0.001）；提示PMEA-1c較ADV在大鼠體內生物利用度存在一定優勢。

3 討論

本研究建立了高效液相色譜串聯質譜法檢測大鼠血漿中PMEA的血藥濃度。由于檢測時PMEA與葛根素的響應度較為接近，葛根素在整個檢測過程中性質穩定，因此選用葛根素作為內標[11-13]。在該方法下，PMEA與內標葛根素具有良好的分離度，血漿內源性物質對樣品的測定沒有干擾，表明該方法專屬性強、靈敏度高、穩定性好，符合生物樣品的檢測要求。

本實驗藥動學參數利用DAS 2.0軟件計算分析，對比擬合的單室、二室、三室模型的AIC（赤池信息判據最小原則，衡量統計模型擬合優良性的標準），其中單室模型AIC最小，因此初步判斷PMEA-1c的代謝為單室模型。ADV、PMEA-1c經大鼠灌胃后的tmax分別為0.750、1.000 h，表明這兩種PMEA前藥均可以在較短時間內釋放出PMEA從而發揮藥效。相關研究發現，ADV單劑量口服在大鼠、小鼠、猴以及狗中，均能迅速釋放原藥PMEA[14-15]，由于PMEA-1c含有相對復雜的結構，在大鼠體內釋放PMEA較慢，這可能是PMEA-1c的tmax較長的原因之一。PMEA-1c組的cmax較大，AUC0-24 h存在明顯優勢，可能是因為PMEA-1c結構中的內源性膽酸被膽汁酸轉運蛋白（NTCP）特異性識別，主動轉運提高了藥物的吸收，也可能正是因為這個原因，使得PMEA-1c在肝富集，PMEA-1c組的t1/2z [（6.298±1.335） h]比ADV組的t1/2z[（8.309±1.446） h]短，消除更快。

綜上所述，本研究建立的方法準確可靠，實驗結果提示PMEA-1c較ADV在大鼠體內生物利用度存在一定優勢，可作為PMEA前藥的潛力藥物，為PMEA前藥的繼續研究奠定了基礎，但是關于PMEA-1c的在動物體內的組織分布以及是否存在腎毒性等還需進一步研究證實。

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（收稿日期：2018-11-09 修回日期：2019-02-11）

（編輯：唐曉蓮）