基于CUMS大鼠川芎揮發油抗抑郁癥作用研究

吳玲 唐宇 鄭琴

摘要 目的：研究川芎揮發油對抑郁模型大鼠行為學及腦內多巴胺、去甲腎上腺素的影響。方法：將72只SD雄性大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組、川芎揮發油低、中、高劑量組，通過應激實驗建立大鼠CUMS抑郁模型，對其進行相關治療后，考察行為學變化，同時采用LC-MS/MS檢測腦組織中DA、NE含量。結果：與模型組比較，各劑量川芎揮發油組均能不同程度改善CUMS抑郁模型大鼠曠場實驗水平得分和糖水偏愛百分比，減少強迫游泳靜止不動時間和增加大鼠體質量;川芎揮發油中劑量組可極顯著提高CUMS抑郁模型大鼠海馬區DA的含量（P<0.01），川芎揮發油低、高劑量組可顯著增加CUMS抑郁模型大鼠海馬區DA的含量（P<0.05）;川芎揮發油低劑量組可極顯著增加CUMS抑郁模型大鼠紋狀體NE的含量（P<0.01），川芎揮發油中、高劑量可顯著增加CUMS抑郁模型大鼠前額葉和紋狀體NE的含量（P<0.05）。結論：川芎揮發油能改善CUMS抑郁模型大鼠曠場實驗水平得分和糖水偏愛百分比，減少強迫游泳靜止不動時間和增加大鼠體質量，顯著提高CUMS抑郁模型大鼠海馬區DA含量，前額葉和紋狀體NE的含量，表明川芎揮發油抗抑郁作用可能與提高前額葉、紋狀體NE含量及海馬區DA含量有關。

關鍵詞 川芎揮發油;抑郁;行為學;神經遞質;大鼠;曠場實驗

Abstract Objective：To study the effects of volatile oil of Rhizoma Ligustici Chuanxiong on behavior，brain dopamine and norepinephrine in rats with depression.Methods：A total of 72 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a blank group，a model group，a positive drug group，and a low，medium and high dose group of volatile oil from Rhizoma Ligustici Chuanxiong.The CUMS depression model was established by stress test.After treatment，the behavioral changes were examined，and the contents of DA and NE in brain tissue were detected by LC-MS/MS.Results：Compared with the model group，each dose of volatile oil of Rhizoma Ligustici Chuanxiong could improve the level of sputum test and the percentage of sucrose preference in the CUMS depression model rats，reduce the resting time of forced swimming and increase the body weight of rats.The medium group could significantly increase the content of DA in hippocampus of CUMS depression model rats（P<0.01）.The low and high doses of Rhizoma Ligustici Chuanxiong volatile oil could significantly increase the content of DA in hippocampus of CUMS depression model rats（P<0.05）.The medium and high dose group could significantly increase the content of striatum NE in CUMS depression model rats（P<0.01）.The high and medium doses of Rhizoma Ligustici Chuanxiong volatile oil can significantly increase the content of prefrontal and striatum NE in CUMS depression model rats（P<0.05）.Conclusion：The volatile oil of Rhizoma Ligustici Chuanxiong can improve the open field test score and the percentage of sugar water preference in CUMS depression model rats，reduce the static immobility time and increase the body weight of rats，and significantly increase the DA content，prefrontal lobe and the content of striatum NE in hippocampus of CUMS depression model rats，which showed that the antidepressant effect of volatile oil of Rhizoma Ligustici Chuanxiong may be related to the increase of NE content in prefrontal cortex and striatum and DA content in hippocampus.

Key Words Volatile oil of Rhizoma Ligustici Chuanxiong; Depression; Behavior; Neurotransmitter; Rat; Open field experiment

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.004

抑郁癥是一種常見的情感性精神障礙疾病，主要表現為心境低落、思維遲緩、意志活動減退、認知功能損害、食欲不振、睡眠障礙、軀體癥狀等，嚴重者有自殺念頭甚至自殺行為，且抑郁癥具有高發病率、高復發率、高致殘率和高自殺率的特點[1]。世界衛生組織預測，到2030年抑郁癥將成為全球最大的疾病負擔[2]，也將成為僅次于心腦血管疾病的第二大疾患。近來抑郁癥己成為醫學研究的熱點之一。

抑郁癥的發生與遺傳、生物、生理和社會等多種因素有關，其發病機制涉及神經、內分泌、免疫等多方面的改變。神經遞質是一類在神經元突觸間起信息傳遞作用的特定化學物質，主要存在于神經系統中，在神經元內合成后，由突觸前膜釋放并立即與相應的突觸后膜受體結合從而發揮調節機體生理功能的作用。根據神經遞質成分，可將其分成4大主要類別，如氨基酸、單胺類，肽類及其他[3-5]。神經遞質及其代謝產物廣泛分布于中樞和外周神經系統，在維持各項生命活動中起著非常重要的作用。研究證實，神經遞質的異常或紊亂與許多神經疾病密切相關，如帕金森疾病、焦慮、精神分裂、抑郁癥和阿爾茲海默病等[6]。許多研究表明，神經遞質積極參與對海馬神經發生的調節，從而影響抑郁癥的發生率[7-8]。目前，臨床上治療抑郁癥的藥物主要是五羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺再攝取抑制劑，通過增強去甲腎上腺素、五羥色胺和多巴胺能神經功能，從而發揮抗抑郁作用，但同時也表現出一系列不良反應，如：使人困倦、口干、視物模糊、便秘、心跳加快、排尿困難和體位性低血壓等，偶爾出現嚴重的心血管不良反應、尿潴留和腸麻痹，過量可致急性中毒甚至死亡。

川芎（Ligusticumchuanxionghort）是傘形科藁本屬多年生草本川芎的干燥根莖，有活血行氣、祛風止痛之功效。《本草綱目》記載“人頭穹窮高，天地之象也，此藥上行，專治頭腦諸疾，故有穹窮之名”[9]。《醫學衷中參西錄·川芎解》曰：川芎“其特長在能引人身清輕之氣上至于腦”[10]。川芎不僅具有“上達顛頂，下至血海，旁及四肢”的特性，也具有“引藥上行，佐使之功”。文獻報道，川芎對血管性抑郁癥具有腦保護作用，其通過清除自由基、改善腦血流及調控凋亡基因的表達等發揮抗抑郁作用[11]。盛艷梅等[12]研究證實，與模型組比較，川芎揮發油組明顯降低大鼠腦梗死體積，丙二醛（MDA）含量顯著降低，而超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）活性及一氧化氮（NO）含量較模型組顯著提高，表明川芎揮發油對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制為清除氧自由基，降低脂質過氧化引起的損傷，達到對血管性抑郁癥的腦保護作用。凌婧等[13]研究發現，川芎揮發油通過降低局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠血漿中腫瘤壞死因子含量，從而發揮作用。本課題研究不同劑量的川芎揮發油對抑郁模型大鼠行為學及腦內神經遞質DA、NE含量的影響，為治療抑郁癥的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠，體質量200～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.1.2 藥物 多巴胺鹽酸鹽（上海源葉生物科技有限公司，純度98.5%，生產批號：Z05M8R35225）;去甲腎上腺素（北京百靈威科技有限，純度98%，生產批號：L660R104）;川芎揮發油（南京澤朗生物科技有限公司，藁本內酯含量為50.27%，生產批號：ZL161009239）。

1.1.3 試劑與儀器 鹽酸氟西汀（常州四藥制藥有限公司，規格10 mg）;3，4-二羥基芐胺氫溴酸鹽（美國sigma-Aldrich公司，純度98%，生產批號：MKBS7646）;乙腈（Tedia，色譜純）;甲酸（國藥，分析純）。萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，型號EL104）;透明水箱（訂做，型號1.5 m×1 m×0.5 m）;高速冷凍離心機（德國SIGMA公司，型號SIMA3-18 K）;MILLI-Q超純水儀（美國Millipore公司，型號Advantage A10）;十萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，型號Sartorivs BT25S）;液質聯用儀器（美國AB SCIEX公司，型號AB Triple Quad 5500）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將大鼠隨機分為6組，每組12只，分別為空白組（生理鹽水組），模型組（生理鹽水組），陽性藥組（氟西汀，2.10 mg/kg），川芎揮發油低、中、高劑量組（5.25、10.50、15.75 mg/kg）。

1.2.1.1 長期不可預見性溫和應激CUMS抑郁模型大鼠的制備 參照Willner[14]等的方法并加以改進，建立大鼠CUMS抑郁模型。空白組供給維持飼料及飲水，不接受任何刺激，其他9組單籠飼養接受25 d CUMS，主要包括4 ℃冰水游泳、晝夜顛倒、夾尾、振蕩、禁食（24 h）、禁水（24 h）、超聲刺激30 min、濕墊料、空調調至17 ℃。每組動物每天隨機給予1種刺激，同1種刺激累計使用不超過5次。每種應激的具體操作方法如下：冰水游泳，將大鼠放入盛有4 ℃冷水（冰水混合物）的水箱中，水深30 cm，持續5 min;晝夜顛倒，白天將大鼠置于黑布圍成的黑暗空間中，持續12 h，夜晚將大鼠置于白熾燈照射的明亮空間中，持續12 h;夾尾，用燕尾夾夾住距大鼠尾部5 cm處，每次同時夾4只大鼠放至同一大鼠籠中，持續30 s;振蕩，將大鼠置于小鼠籠中，手動振蕩1 min后停止;禁食，停止供給飼料24 h;禁水，停止供水24 h;超聲刺激，將頻率為50 Hz超聲清洗器搬至動物房，接通電源，持續30 min。

1.2.1.2 實驗動物模型評價 1）大鼠體質量的測量：大鼠分別于CUMS造模前一天（即第0天），停止造模后一天（即第26天時）稱重，給藥25 d后（即第51天）稱重。2）曠場實驗：參照文獻稍作修改[15]，實驗所用敞箱為立方體（1 m×1 m×0.5 m），周壁、底面均為黑色，底面劃分為面積相等的25塊。將大鼠放置于視頻監測下的敞箱底部中心方格內，以大鼠3爪穿越底面方塊數為水平活動得分。每只大鼠測定1次，每次測定時間為5 min，記錄5 min內大鼠穿越橫格數量，每跨一格得1分。大鼠在CUMS造模前一天即第0天，停止造模后1 d即第26天時，灌胃給藥25天后即第51天進行曠場實驗。3）糖水消耗量實驗：參照文獻[16]計算大鼠1 h飲用1%蔗糖溶液百分比（糖水消耗量/總液體消耗量×100%）作為評價指標。糖水偏好訓練與測試前大鼠禁食禁水24 h，實驗時，大鼠單只放在鼠籠，每個鼠籠上放置2個已稱好重量的水瓶，分別為1%蔗糖水和飲用水。大鼠在CUMS造模前一天即第0天，停止造模后1 d即第26天時，灌胃給藥25 d后即第51天進行進行糖水消耗量實驗。4）強迫游泳實驗：參照Porsolt[17]建立的方法進行改進，將大鼠放在裝有的自來水的透明玻璃缸（1.5 m×1 m×0.5 m）中，強迫游泳后將大鼠取出用吹風機將毛發上的水吹干。判定不動的標準是大鼠在水中停止掙扎，呈直立漂浮狀態，僅有偶而的肢體運動以保持頭部浮在水面，適應1 min，記錄大鼠5 min內靜止不動時間。大鼠在CUMS造模前一天即第0天，停止造模后1 d，即第26天，灌胃給藥25 d后即第51天進行進行強迫游泳實驗。5）懸尾實驗：根據Lucien Steru[18]等建立的方法進行改進，2個白色透明的大鼠籠合并組成一個密閉環境，人手捏住在距大鼠鼠尾端處7 cm將大鼠固定，使其呈倒懸狀態，觀察判定靜止不動時間的標準是大鼠停止掙扎，身體呈微小幅度搖擺狀態，適應1 min，記錄5 min累計靜止不動時間。大鼠在CUMS造模前一天即第0天，停止造模后1 d，即第26天時進行懸尾實驗。

1.2.2 給藥方法 所有藥物通過灌胃以100 g體質量給藥2 mL的體積進行給藥，1次/d，持續25 d。

1.2.3 檢測指標與方法 腦組織樣品的處理方法：大鼠頸椎脫臼處死后，取腦組織，生理鹽水洗凈，并在冰盤上迅速分離雙側紋狀體，海馬組織，前額葉皮層，分別置于1.5 mL離心管中，稱重后置于-80 ℃冰箱保存。測試前從冰箱取出，腦組織：0.1%甲酸水=1∶ 4（m/V）勻漿，10 000 r/min離心10 min，取上清液。取50 μL勻漿上清液液于1.5 mL的離心管中，加入10 μL 20 μg/mL的內標DHBA溶液，200 μL乙腈沉淀蛋白，振蕩1 min，17 000 r/min離心10 min，取上清液于液相色譜樣品瓶中，進行LC-MS/MS分析測定。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以（±s）表示。組間比較使用單因素方差分析（One Way=ANOVA）。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對CUMS抑郁模型大鼠體質量的影響 造模前各組大鼠體質量差異無統計學意義。造模完成后，模型組、陽性藥組、川芎揮發油低、中、高劑量組體質量均極顯著低于空白組（P<0.01），造模后連續灌胃給藥25 d后，模型組大鼠體質量增長趨勢明顯減緩，極顯著低于空白組（P<0.05）;陽性藥組大鼠體質量明顯增長，顯著高于模型組（P<0.05），接近空白組大鼠體質量。見表1。

2.2 對CUMS抑郁模型大鼠1%蔗糖水消耗量影響 ?造模前各組大鼠蔗糖水消耗量差異無統計學意義。造模完成后，模型組、陽性藥組、川芎揮發油低、中、高劑量組蔗糖水消耗量均極顯著低于空白對照組（P<0.01）;造模后連續灌胃給藥25 d后，陽性藥組、川芎揮發油高劑量組糖水消耗量極顯著高于模型組（P<0.01）;川芎揮發油低、中劑量組糖水消耗量顯著高于模型組（P<0.05）。見表2。

2.3 對CUMS抑郁模型大鼠曠場實驗的影響 造模前各組大鼠水平運動得分差異無統計學意義。造模完成后，模型組、陽性藥組和川芎揮發油低、中劑量組水平運動得分均極顯著低于空白組（P<0.05、0.01）;造模后灌胃給藥25 d，與模型組比較，陽性藥組、川芎揮發油低、高劑量組的大鼠曠場實驗水平得分顯著增加（P<0.05、0.01）。見表3。

從大鼠的運動軌跡看，未造模的大鼠行動能力活躍，大鼠在黑色邊框的曠場內四處走躥，以期尋找出口。造模后的大鼠行動相對變得遲緩，其5 min內跨越格子數明顯變少，其平均爬行速度也明顯降低。見圖1。

2.4 對CUMS抑郁模型大鼠強迫游泳實驗的影響 ?造模前各組大鼠強迫游泳不動時間差異無統計學意義。造模完成后，模型組、陽性藥組和川芎揮發油低、中劑量組水平運動得分均極顯著低于空白組（P<0.01，P<0.05）;造模后灌胃給藥25 d后，與模型組比較，陽性藥組、川芎揮發油高劑量組的大鼠強迫游泳不動時間顯著增加（P<0.01）。見表4。

2.5 腦組織中DA含量變化 與空白組比較，模型組大鼠海馬區DA含量極顯著性降低（P<0.01），前額葉皮層DA含量未檢測到，紋狀體DA含量差異無統計學意義。與模型組比較，川芎揮發油中劑量組海馬區DA含量極顯著升高（P<0.01）;陽性藥組、川芎低、高劑量組顯著性升高（P<0.05）。模型組與陽性藥組大鼠前額葉皮層均未檢測到含量。與模型組比較，川芎揮發油低劑量組紋狀體DA含量顯著降低，其他給藥組含量差異無統計學意義。見表5。

2.6 腦組織中NE含量變化 與空白組比較，模型組大鼠海馬區NE含量極顯著性降低（P<0.01），前額葉皮層、紋狀體NE含量顯著性降低（P<0.05）。與模型組比較，川芎揮發油低、高劑量組海馬區NE含量極顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，川芎揮發油中劑量組前額葉皮層NE量顯著升高（P<0.05），其他給藥組含量比較差異無統計學意義。與模型組比較，陽性藥組、川芎揮發油中、高劑量組紋狀體NE含量顯著升高（P<0.05），其他給藥組含量比較差異無統計學意義，川芎揮發油低劑量組紋狀體NE含量極顯著升高（P<0.01），其他給藥組差異無統計學意義。見表6。

3 討論

強迫游泳、糖水偏好率、曠場是較為常用的、經典的抑郁模型，模型所表現出的心境低落、思維遲緩、意志活動減退、行為扭曲等癥狀是模擬抑郁癥的顯著特征。我們的結果發現，大鼠在經過25 d CUMS造模后，模型組大鼠跨越格子數和平均爬行速度明顯降低，糖水偏好指數及體質量下降，強迫游泳不動時間增加，提示CUMS抑郁模型構建成功。用川芎揮發油治療抑郁大鼠25 d后，明顯改善大鼠曠場實驗水平得分和糖水偏愛百分比，減少強迫游泳靜止不動時間和增加大鼠體質量，表明川芎揮發油具有良好的抗抑郁活性。

抑郁癥的發病機制公認為單胺類假說，患者腦內5-HT能、NE能及DA能低下假說。抑郁癥患者中樞神經受損部位主要為海馬區、前額葉皮層、紋狀體等[19]。海馬作為人類和其他脊椎動物大腦的重要組成部分，承擔了學習、記憶和空間定位等重要功能。海馬神經發生與記憶的形成密切相關，同時在學習任務中起著重要作用[20]。研究發現，兒童時期應激導致的重癥抑郁患者腦形態學與正常人比較，海馬體積顯著減小[21]。紋狀體是基底神經節重要的輸入核團，除運動控制外，還與各種依賴皮層神經元活動的行為、學習記憶、認知及記憶功能的產生和執行有關[22]。CUMS抑郁模型大鼠紋狀體DA、NE含量均顯著減少，行為絕望模型小鼠紋狀體中DA含量顯著降低[23-24]。大腦額葉包括前區、中區和后區，是一個重要的神經組織區域。前區就是我們常說的腦前額葉，對人的思維活動與行為表現有十分突出作用，與智力密切相關。研究發現，兒童時期應激導致的重癥抑郁患者腦形態學與正常人比較，前額葉皮層積顯著減小[25]。因此，我們在實驗中分別選擇海馬、紋狀體及大腦額葉，研究川芎揮發油對CUMS抑郁模型大鼠DA、NE含量的影響。結果發現，川芎揮發油抗抑郁作用與提高前額葉、紋狀體NE含量及海馬區DA含量有關。川芎揮發油抗抑郁活性作用的發揮與其他神經遞質是否存在密切的關系，需要進一步的深入探討。

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（2019-06-05收稿 責任編輯：徐穎）