甲氟喹增強紫杉醇誘導胃癌細胞BGC- 823細胞凋亡的機制

李 云，陳 博，王 凡

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，在全球呈多發趨勢，且病死率較高，胃癌的發病率、死亡率分別位于惡性腫瘤的第5位及第3位，嚴重威脅著人類健康[1]。其治療主要以手術切除聯合周圍淋巴結清掃為主，除此之外，化療在胃癌的治療上也起到重要的輔助作用[2]。紫杉醇是一種新型的紫杉類藥物，臨床上常用于晚期胃癌的治療[3-4]，但對紫杉醇不敏感的胃癌細胞株能否通過其他藥物的協同作用增強其對化療藥物的敏感性，值得進一步探討。甲氟喹是FDA批準的治療和預防瘧疾的藥物，在過去的幾年里，甲氟喹被嘗試用于治療其他疾病，且取得明顯的效果。研究表明，甲氟喹可以作為一種新型抗癌藥物用于惡性腫瘤的治療，Sukhai et al[5]采用甲氟喹作用于急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)細胞，發現其可通過滲透入白血病細胞的溶酶體中，破壞溶酶體膜蛋白，進而有選擇性的殺死白血病細胞及干細胞，為通過破壞細胞溶酶體治療AML提供了理論依據。Li et al[6]研究表明甲氟喹可通過抑制腫瘤細胞線粒體增殖及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路誘導宮頸癌細胞的凋亡，且與紫杉醇聯合應用起到協同作用。然而，甲氟喹對紫杉醇不敏感型胃癌的作用及其分子機制鮮有報道。磷脂肌醇3- 激酶(phosphoinositide- 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路是人體細胞中的一條重要信號傳導通路，在細胞中起著促進增殖、抑制凋亡的作用，與包括胃癌在內的多種腫瘤的發生及發展緊密相關[7-8]。能夠識別并抑制PI3K/Akt/mTOR通路的藥物可能提高胃癌治療的療效。該研究將甲氟喹和紫杉醇聯合作用于對紫杉醇不敏感的胃癌細胞株BGC- 823，研究兩藥聯合對紫杉醇不敏感胃癌細胞的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑SGC- 7901及BGC- 823細胞購自中科院上海細胞庫。DMEM高糖培養基、胰酶購自Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青公司；甲氟喹和紫杉醇購自美國Sigma- Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人胃腺癌細胞系SGC- 7901及BGC- 823細胞采用含10%小牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養液于37 ℃、5% CO2培養箱內培養，細胞呈貼壁性生長。

1.2.2PI染色流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集對數期細胞，以每孔板2×103個細胞密度接種于96孔板(200 μl/孔，37 ℃、5% CO2，飽和濕度，邊緣孔用無菌PBS填充)。細胞貼壁后即加入藥物，實驗組分別加入0.5 μmol/L甲氟喹，0.3 μmol/L紫杉醇，0.5 μmol/L甲氟喹聯合0.3 μmol/L紫杉醇，同時設對照組(只加細胞和培養液，不加藥物)。收集藥物作用后的細胞上清液，用預冷PBS洗滌2次，低速離心棄上清液，每孔加入750 μl熒光染料碘化丙啶(PI)，37 ℃避光作用20 min后收集細胞，4 ℃避光過夜。次日使用流式細胞儀(FASCalibur)檢測。每組實驗重復3次。結果用WinMDI 2.9軟件分析，亞二倍體峰(subG1)所占的比例即細胞凋亡率。

1.2.3MTS測定細胞活性 細胞貼壁后實驗組分別加入0.5 μmol/L甲氟喹，0.3 μmol/L紫杉醇，0.5 μmol/L甲氟喹聯合0.3 μmol/L紫杉醇，同時設對照組(只加細胞和培養液，不加藥物)。5% CO2、37 ℃孵育24 h后每孔加20 μl MTS/PMS混合液，繼續培養4 h。檢測前搖晃培養板10 s，混勻顏色。在酶聯檢測儀上，波長570 nm處檢測各孔的吸光度值。

1.2.4Western blot法 將BGC- 823細胞接種到6孔板中，對照組加入培養液，實驗組分別加入0.5 μmol/L甲氟喹，0.3 μmol/L紫杉醇，0.5 μmol/L甲氟喹聯合0.3 μmol/L紫杉醇，培養24 h后收集細胞，在冰上加入RIPA細胞裂解液裂解細胞，于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，吸取上清液。BCA蛋白定量法測總蛋白的濃度。在15% SDS- PAGE膠中每孔加入蛋白總量30 μg，電泳條件為70 V/40 min，110 V/90 min。220 mA、60 min轉膜至PVDF膜上，用含5%的脫脂奶粉/TBST室溫封閉2 h，LC3抗體4 ℃ 孵育過夜，次日TBST洗滌3次，每次10 min；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；于全自動數碼凝膠圖像分析系統中進行曝光，檢測p- PI3K、PI3K、p- Akt、Akt、p- mTOR、mTOR表達水平并保存圖像。

2 結果

2.1 紫杉醇誘導胃腺癌細胞凋亡選用0.3 μmol/L紫杉醇在不同時間點分別處理SGC- 7901和BGC- 823細胞，檢測其凋亡率，結果顯示紫杉醇誘導SGC- 7901細胞48 h凋亡率為(55.33±2.08)%，BGC- 823的凋亡率為(23.33±1.53)%，說明紫杉醇對SGC- 7901和BGC- 823細胞都有誘導凋亡作用，但相比較而言，BGC- 823細胞對紫杉醇誘導的凋亡更加不敏感，差異有統計學意義(F=19.05，P<0.05)，見圖1。

圖1 48 h內紫杉醇誘導胃腺癌細胞BGC- 823和SGC- 7901凋亡率的變化

2.2 甲氟喹能夠抑制細胞活性且增加BGC- 823細胞對紫杉醇的敏感性在對紫杉醇不敏感的細胞株BGC- 823中分別加入0.5 μmol/L甲氟喹、0.3 μmol/L紫杉醇、0.5 μmol/L甲氟喹聯合0.3 μmol/L紫杉醇，同時設對照組(只加細胞和培養液，不加藥物)。通過染色流式細胞術檢測細胞凋亡率，MTS檢測細胞活性，結果顯示，甲氟喹聯合紫杉醇較單用紫杉醇能更明顯地誘導BGC- 823細胞凋亡[(33.00±2.83)%vs(15.75±0.64)%]，抑制細胞增殖[(44.00±0.07)%vs(72.00±0.09)%]，差異均有統計學意義(F=13.18，P<0.05；F=22.58，P<0.05)(圖2A、2B)。

圖2 各組處理24 h后胃癌細胞BGC- 823凋亡率、增殖率比較

A： 凋亡率比較；B：增殖率比較；1：對照組；2：0.5 μmol/L甲氟喹；3：0.3 μmol/L紫杉醇；4：0.5 μmol/L甲氟喹+0.3 μmol/L紫杉醇；與對照組比較：*P<0.05；與單藥紫杉醇組比較：#P<0.05

圖3 甲氟喹、紫杉醇對胃癌細胞BGC- 823中PI3K/Akt/mTORA信號通路總蛋白及磷酸化蛋白表達水平的影響

A：Western blot圖像；B：mTOR蛋白相對灰度值；C：p- mTOR蛋白相對灰度值；1：對照組；2：0.5 μmol/L甲氟喹；3：0.3 μmol/L紫杉醇；4：0.5 μmol/L甲氟喹+0.3 μmol/L紫杉醇；與對照組比較：*P<0.05；與單藥紫杉醇組比較：#P<0.05

2.3 甲氟喹通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路增強胃癌細胞BGC- 823對紫杉醇的敏感性在對紫杉醇不敏感的細胞株BGC- 823中分別加入0.5 μmol/L甲氟喹、0.3 μmol/L紫杉醇、0.5 μmol/L甲氟喹聯合0.3 μmol/L紫杉醇，Western blot法檢測PI3K/Akt/mTOR通路的總蛋白及磷酸化蛋白的表達水平。結果顯示，無藥物處理組中PI3K/Akt/mTOR通路的總蛋白及磷酸化蛋白相關基因表達水平較高，而甲氟喹聯合紫杉醇作用后，PI3K/Akt/mTOR通路的總蛋白相關基因表達水平無變化，但磷酸化蛋白較單用甲氟喹，紫杉醇處理的實驗組及無藥物處理組明顯降低，說明甲氟喹可以協同紫杉醇抑制PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化蛋白的表達水平，差異有統計學意義(F=13.05，P<0.05)，見圖3A、3B、3C。

3 討論

胃癌在我國發病率較高，是一種常見的消化道惡性腫瘤，因早期胃癌診斷率較低，多數患者發現時已處于中晚期。近年來，胃癌發病率不斷上升，與飲食結構、環境改變等多種因素有關[9]。胃癌的發生及進展是一個多因素、多步驟的復雜過程，多種信號通路與胃癌的發生有關。其中，PI3K/Akt/mTOR信號通路在癌細胞的生長、增殖、凋亡等方面起到重要的調控作用，其可傳遞細胞有絲分裂信號，上調細胞周期素、細胞周期依賴性蛋白激酶等的翻譯，使細胞周期的運行速度加快，促進腫瘤細胞的增殖與分化[6,10]。胃癌細胞通常會表現出明顯的基因組改變，如基因異質性的缺失、非整倍體基因、基因不穩定，導致基因無法正常表達，這是胃癌細胞的自我處理所導致的[8]。當一個細胞處于癌變狀態時，其細胞內的PI3K- Akt信號會增加，mTOR會被激活、細胞的反饋活動會減少。所有這些變化會使細胞代謝增快，血管生成增加、核糖體生成增多，從而改變蛋白質的生物結構，進而引起腫瘤的形成[11]。胃癌死亡率較高，即使行胃癌根治性術后，術后存活期仍較短，其預后主要與癌細胞浸潤胃壁的深度，周圍淋巴結轉移情況有關。研究[12]顯示胃癌淋巴轉移與Akt/mTOR信號通路的活化有關，Akt/mTOR信號蛋白在胃癌細胞中較正常細胞過度表達，導致癌細胞通過淋巴管轉移，影響患者預后。紫杉醇是臨床上較常使用的一種化療藥物，其可有效抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡，但在胃癌的治療上療效欠佳，主要是胃癌細胞對紫杉醇敏感性較差導致。甲氟喹是人工合成的4- 喹啉-甲醇衍生物，能夠有效殺滅紅細胞內裂殖體，主要用于治療瘧疾的藥物。研究[13]表明其良好的細胞毒性可以誘導多種癌細胞的凋亡，在惡性腫瘤的治療中越來越受到人們的重視。本研究將甲氟喹作為胃癌治療的潛在藥物，發現甲氟喹可以作用于對紫杉醇不敏感的胃癌細胞株，抑制癌細胞的增殖，促進其凋亡，與紫杉醇起到協同作用。且發現甲氟喹可以通過抑制PI3K / Akt / mTOR信號通路磷酸化蛋白的活性從而有效抑制腫瘤細胞的增殖。

Liu et al[14]分別建立小鼠體內、體外模型，采用不同類型的胃癌細胞研究甲氟喹對胃癌細胞的影響及作用機制，發現不同濃度的甲氟喹促進胃癌細胞凋亡程度不同，在一定濃度下(0.1～5 μmol/L)，隨著濃度增加，細胞凋亡越明顯；且甲氟喹聯合紫杉醇較兩者單藥使用作用于細胞株，促進凋亡效應更明顯，此外，發現甲氟喹可有效抑制胃癌細胞內的PI3K/Akt/mTOR信號通路磷酸化蛋白的活性，促進胃癌細胞的凋亡。本實驗中，先用紫杉醇分別處理兩種不同的胃癌細胞，得到對紫杉醇敏感性較低的細胞株BGC- 823，再分別用一定濃度的甲氟喹、紫杉醇、紫杉醇聯合甲氟喹處理該細胞株，與前兩者比較，發現甲氟喹聯合紫杉醇可明顯降低細胞株BGC- 823的增殖，促進其凋亡。為進一步明確甲氟喹協同紫杉醇促進胃癌細胞凋亡的機制，分別采用兩者單藥、兩者聯合作用胃腺癌BGC- 823細胞株24 h，檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路中p- PI3K、PI3K、p- Akt、Akt、p- mTOR、mTOR蛋白表達水平。結果發現兩者聯合使用較兩者單藥能顯著抑制上述磷酸化蛋白的活性，說明兩者協同促進胃癌細胞凋亡是通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化蛋白的表達水平來實現的，該結果與Liu et al[14]實驗結果相一致。

綜上所述，甲氟喹作為一種抗瘧藥，此實驗將其作用于胃癌細胞，發現甲氟喹可以作用于對紫杉醇不敏感的胃癌細胞株，抑制癌細胞增殖，促進凋亡，與紫杉醇具有協同作用。進一步的實驗表明甲氟喹協同紫杉醇通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化蛋白的表達水平抑制胃癌細胞增殖，為抗胃癌新藥物的開發提供了一定的理論依據。本研究獲得的所有實驗數據均在體外以細胞培養方式獲得，由于人體內環境中多種因素的影響，甲氟喹聯合紫杉醇對胃癌細胞的抑制作用機制還需要在動物模型中進一步深入研究。