GM試驗(yàn)診斷非粒缺患者侵襲性肺曲霉菌病的臨床價(jià)值研究

王月 鄒燕萍 孔蓓蓓 成軍 孫長貴 徐煒

曲霉菌是一種條件致病真菌，廣泛存在自然界，當(dāng)宿主免疫力低下，長期使用免疫抑制劑、激素和抗生素，異體造血干細(xì)胞移植（HSCT），惡性血液病患者中極易感染導(dǎo)致侵襲性肺曲霉菌病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）［1］。侵襲性肺曲霉菌病缺乏特異的臨床癥狀，早期診斷困難，病死率高［2］。半乳甘露聚糖抗原（galactomannan，GM）試驗(yàn)，作為診斷IPA的微生物學(xué)依據(jù)，在粒細(xì)胞缺乏的血液病以及異基因移植患者中得到大量驗(yàn)證，但在非粒缺的患者中診斷依據(jù)不足［3］。曲霉菌常侵襲支氣管和肺導(dǎo)致肺曲霉菌病，而呼吸科患者如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核等存在肺部基礎(chǔ)疾病暴露在曲霉菌環(huán)境中亦易受曲霉菌感染，由于缺乏特異性臨床癥狀，病程周期長，病死率高［4］。在臨床應(yīng)用中，其他科室如呼吸科等缺乏GM的參考值，直接套用血液疾病患者以0.50作為cut-off值，這是否合適也需要進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，本研究回顧性分析本院非粒缺肺部感染的呼吸科住院患者臨床資料，利用ROC曲線計(jì)算血清GM試驗(yàn)診斷IPA的cut-off值，并評(píng)價(jià)其臨床診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月至2017年7月本院呼吸科存在侵襲性真菌感染因素386例住院患者，排除血液系統(tǒng)疾病和粒細(xì)胞缺乏、非呼吸系統(tǒng)疾病，提前進(jìn)行抗真菌治療，診斷不明共29例；由于擬診患者診斷并不明確，存在疑問，故排除擬診10例；入組347例患者分IPA組 42例，其他真菌感染組60例，排除診斷組245例，其臨床資料見表1。

表1 入組患者的臨床特征［n（%）］

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) IPA的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007版中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)感染學(xué)組制定的肺真菌病診斷和治療專家共識(shí)，分確診、臨床診斷、擬診和排除診斷［5］。IPA組為臨床上確診和臨床診斷為IPA的患者；其他真菌感染組為微生物學(xué)鑒定為除曲霉菌以外的其它真菌；排除診斷組為臨床癥狀、影像學(xué)以及微生物學(xué)均不支持真菌感染。

1.3 方法 （1）儀器和試劑：GM試驗(yàn)檢測試劑盒采用BIO-RAD公司曲霉菌抗原檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法，批號(hào)6K0043和7F0047），儀器為BIO-RAD iMark酶標(biāo)儀。（2）樣本采集：使用不含β-D-葡聚糖的血清采血管采集空腹受試者的靜脈血3ml，400g離心10min，分離血清后置于2℃～8℃冰箱待測。肺泡灌洗液采用60ml的0.9%無菌生理鹽水分次對(duì)病變的肺段或支氣管段灌洗，收集灌洗液并留取3ml送檢。（3）結(jié)果判定：嚴(yán)格參照GM試驗(yàn)操作說明書，在波長450nm（參考波長620nm）讀取每孔吸光度（OD值），待測GM指數(shù)I=樣本OD值/臨界值對(duì)照OD值均值。每次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和臨界對(duì)照，以驗(yàn)證結(jié)果的有效性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)血清GM試驗(yàn)診斷IPA的ROC曲線進(jìn)行分析，得出血清診斷界值并評(píng)價(jià)其診斷試驗(yàn)診斷價(jià)值，計(jì)量資料服從正態(tài)分布以（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差（ANOVA）分析；不服從正態(tài)分布采用［M（P25，P75）］表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析，組間比較有差異進(jìn)一步采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別血清GM檢測結(jié)果 見表2。

表2 不同組別血清GM檢測結(jié)果

圖1 血清GM試驗(yàn)診斷IPA的ROC曲線

2.2 血清GM試驗(yàn)診斷IPA的ROC曲線 根據(jù)血清GM試驗(yàn)診斷IPA的ROC曲線分析（見圖1），AUC=0.660（95%CI：0.556～0.764），P＜0.01，其最佳診斷界值為0.35。病例組為IPA組，對(duì)照組為其他真菌感染組和排除診斷組。以0.35為診斷界值，血清GM試驗(yàn)診斷IPA的靈敏度為53.85%，特異性為82.39%，陽性預(yù)測值為29.58%，陰性預(yù)測值為92.86%，約登指數(shù)為36.24%。

3 討論

侵襲性肺曲霉菌病臨床表現(xiàn)缺乏特異性，易發(fā)生于惡性血液疾病、異基因移植、長期使用糖皮質(zhì)激素和抗生素等粒細(xì)胞減少患者，近來越來越多報(bào)道發(fā)現(xiàn)非粒細(xì)胞減少的患者發(fā)病率和致死率也較高［1］。呼吸系統(tǒng)疾病患者如COPD等由于存在肺部基礎(chǔ)疾病，當(dāng)并發(fā)侵襲性曲霉感染時(shí)，其臨床癥狀易被基礎(chǔ)疾病掩蓋，且缺乏靈敏的診斷方法，從而延誤治療［6］。在侵襲性肺曲霉菌病，早診斷早治療是提高預(yù)后減少病死率的重要因素［7］，因此，早期診斷格外重要。

GM試驗(yàn)檢測可用來輔助診斷曲霉菌感染［8］。大量研究報(bào)道［9］，在粒缺的患者中，GM試驗(yàn)可用于早期診斷IPA，當(dāng)血清GM指數(shù)cut-off值為0.50時(shí)，靈敏度為73%～90%，特異性為72%～90%。但是在非粒缺的患者中，最佳的血清GM指數(shù)cut-off值是否選取同粒缺患者的0.50值得商榷。很多研究報(bào)道，如Xue等［10］研究以0.50為cut off，其在非粒缺患者IPA診斷靈敏度為40.7%，特異性為89.4%，陽性預(yù)測值為61.1%，陰性預(yù)測值為78.7%；Wei等［11］研究以0.50為cut-off，靈敏度為37.84%，特異性為87.14%。本研究根據(jù)血清GM試驗(yàn)診斷IPA的ROC曲線，得出在非粒缺患者中最佳診斷cut-off值為0.35，AUC=0.660（95%CI：0.556～0.764），P＜0.01，表明GM試驗(yàn)用于非粒缺呼吸科患者的IPA診斷價(jià)值中等偏下；當(dāng)以0.35為cut-off時(shí)，靈敏度為53.85%，特異性為82.39%，陽性預(yù)測值為29.58%，陰性預(yù)測值為92.86%，約登指數(shù)為36.24%，其靈敏度以及靈敏度和特異性之和均高于上述作者以0.50為cut-off值的研究，說明GM在粒缺患者的診斷cut-off值可能不適用非粒缺患者。另外，本研究根據(jù)其ROC曲線，得出GM試驗(yàn)指數(shù)最適的cut-off值為0.35，低于粒缺患者的cut-off值0.50，分析原因可能是在曲霉菌感染時(shí)，非粒缺由于粒細(xì)胞數(shù)量和功能均高于粒缺患者，其清除速度和能力較強(qiáng)，因此血清中剩余的GM較粒缺患者低；也有可能粒細(xì)胞正常的患者其體內(nèi)存在曲霉菌抗體，中和了GM。

對(duì)IPA組、其他真菌感染組及排除診斷組患者GM結(jié)果分析，血清GM中位數(shù)：IPA組＞其他真菌感染組＞排除診斷組。由于半乳甘露聚糖主要存在曲霉菌屬細(xì)胞壁成分之一，但是部分真菌屬如青霉，白地霉和組織胞漿菌對(duì)EBA-2單克隆抗體有反應(yīng)性，也導(dǎo)致GM試驗(yàn)呈陽性［12］，因此部分其他真菌感染患者也出現(xiàn)GM增高，但曲霉菌感染組增高顯著。

由于本次入組IPA患者例數(shù)較少，而且來自單一中心的數(shù)據(jù)，因此需要更多病例數(shù)以及多中心數(shù)據(jù)來驗(yàn)證非粒缺患者診斷IPA的血清GM最佳cut-off值，為臨床診斷提供更精準(zhǔn)的參考依據(jù)。其次，血清GM試驗(yàn)用于診斷非粒缺患者IPA準(zhǔn)確度并不高，目前很多學(xué)者研究Balf GM試驗(yàn)在IPA中診斷價(jià)值，但是Balf 檢測的時(shí)間點(diǎn)、樣本收集量、回收前生理鹽水在肺內(nèi)保留時(shí)間，沖洗次數(shù)和標(biāo)本處理均需要標(biāo)準(zhǔn)化，這樣才能通過多中心數(shù)據(jù)得出客觀有價(jià)值的Balf診斷界值。這可能需要我們?nèi)ふ腋玫闹笜?biāo)或者聯(lián)合應(yīng)用新的檢測技術(shù)提高對(duì)IPA診斷的準(zhǔn)確度。