未成熟大鼠睪丸組織玻璃化凍存效果的比較性研究

童越，傅龍龍，安琪，賈艷飛，張開舒，趙海豹，周芳，郭穎，盧文紅，梁小薇，唐文豪，谷翊群*

(1. 國家衛生健康委科學技術研究所男性臨床研究室/國家衛生健康委男性生殖健康重點實驗室/北京人類精子庫，北京 100081；2. 北京協和醫學院研究生院，北京 100730；3. 蘭州大學第二臨床醫學院神經外科，蘭州 730000；4. 青島大學附屬醫院生殖中心，青島 266000；5. 北京大學第三醫院泌尿外科，北京 100191)

在生殖醫學臨床實踐中，添加甘油-卵黃-檸檬酸鹽冷凍保護劑、采用程控或手工慢速冷凍的精子凍存技術是男性生育力保存的首選方法[1]。對于需要接受生殖腺毒性治療的青春期前男性患者，由于睪丸內尚無成熟精子，凍存睪丸組織或生精干細胞成為他們保留生育機會的唯一選擇[2]。國外已有多家醫療機構為青春期前的男性患者凍存了睪丸組織，以備未來利用輔助生殖技術(ART)幫助患者生育自己的遺傳學后代[3-4]。

睪丸組織冷凍技術主要有慢速冷凍和玻璃化冷凍兩大類。目前臨床上在卵母細胞凍存實踐中，玻璃化技術已經逐步取代慢速冷凍技術[5]。對于睪丸組織凍存，玻璃化和慢速冷凍兩種方法何者效果更好還存在爭議[6-8]，但由于玻璃化技術使用便利、成本低，因此更利于臨床推廣。二甲基亞砜(DMSO)和乙二醇(EG)是睪丸組織玻璃化凍存最常使用的冷凍保護劑成分，然而不同濃度的DMSO和EG對玻璃化凍存的大鼠睪丸組織的結構和細胞功能有何影響還不完全清楚。

本研究選擇兩周齡大鼠來模擬人在青春期前無精子產生的未成熟發育狀態，使用不同濃度的凍存液對大鼠睪丸組織進行玻璃化冷凍，以探討未成熟大鼠睪丸組織玻璃化凍存的適宜濃度方案。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物：兩周齡的SD雄性大鼠購自北京華阜康實驗動物中心[證號：SCXK(京)2014-0004]，體重為(43.0±5.6)g。飼養溫度為(22±2)℃，相對濕度(55±5)%，光照黑暗時間比為14 h/10 h。本研究經國家衛生健康委科學技術研究所倫理委員會審核通過。

2.主要實驗儀器：激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，美國)、生物組織包埋機(Leica，德國)、輪轉式切片機(Leica，德國)、電熱恒溫水浴箱(上海智誠)。

3.主要實驗試劑：DMSO、EG、蔗糖等購自美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；TUNEL熒光試劑盒購自瑞士Roche公司；1 μl塑料細菌接種環購自美國Biologix公司；兔抗大鼠SOX9單克隆抗體、兔抗大鼠StAR多克隆抗體、小鼠抗大鼠UCHL1多克隆抗體均購自英國Abcam公司，兔抗大鼠PCNA單克隆抗體購自美國CST公司。

二、實驗方法

1.睪丸組織取材：大鼠麻醉后脫頸處死，下腹部切口取出兩側睪丸，于PBS緩沖液漂洗2次，去除白膜后移入含10%FBS的DMEM/F12培養基中，4℃靜置，待一次實驗中所有睪丸取出后，將每個睪丸分割為大小約為8 mm3～9 mm3的組織塊。分到對照組的組織塊立即進行固定，凍存組進入冷凍流程。

2.玻璃化冷凍和復蘇：參考Curaba等[9]的研究，設計3個不同濃度冷凍保護劑的玻璃化凍存組和1個對照組。對照組的睪丸組織不作冷凍處理，直接進行后續實驗。3種不同濃度的玻璃化凍存液配方如下：玻璃化A組(A組)凍存液為含7.5%DMSO、7.5%EG、0.5 mol/L蔗糖和10%FBS的DMEM/F12培養基；玻璃化B組(B組)為含15%DMSO、15%EG、0.5 mol/L蔗糖和10%FBS的DMEM/F12培養基；玻璃化C組(C組)為含25%DMSO、25%EG、0.5 mol/L蔗糖和10%FBS的DMEM/F12培養基。各組平衡液的DMSO和EG濃度是對應凍存液濃度的50%，FBS體積分數不變，不添加蔗糖。各組凍存樣本復蘇時使用相同的復蘇液。復蘇液1(WS1)：含1.0 mol/L蔗糖、10%FBS的PBS；復蘇液2(WS2)：含0.5 mol/L蔗糖、10%FBS的PBS；復蘇液3(WS3)：含0.25 mol/L蔗糖、10%FBS的PBS。將分割好的睪丸組織置于平衡液中4℃孵育20 min，然后轉入凍存液(VS)中4℃孵育25 min。取出組織在紗布上稍拭干，穩妥放置在截好的1 μl接種環上，空氣中停留5 s后直接浸入液氮中。在液氮液面下，用鑷子將載有組織的小環夾入預冷的凍存管中，封口，移入液氮罐。樣本在液氮中保存2周后進行復蘇。

玻璃化樣本的復蘇采用快速復溫方式：自液氮中取出凍存管，立即置于37℃水浴，快速夾出睪丸組織置于37℃的WS1中停留約1.5 min，使組織從小環上脫落至溶液中并充分浸潤。接著將組織依次在37℃的WS2、WS3中各靜置5 min，再用含10%FBS的PBS漂洗2次。

3.睪丸組織形態學觀察：新鮮或凍融后的睪丸組織在Bouin’s液中固定24 h后，常規石蠟包埋切片，H&E染色后封片，鏡下觀察。一次實驗中每組隨機選取5塊組織，每塊組織分析3個切面，共進行3次獨立重復實驗。參考Milazzo等[10]研究中提供的半定量評分標準，從生精小管內細胞形態和生精上皮與基底膜完整性兩方面對凍融后睪丸組織形態學改變進行評分，每個切面評分之和介于0～10分。

4.免疫熒光染色：選擇相應抗體對組織石蠟切片中精原細胞標志物UCHL1、支持細胞標志物SOX9、睪丸間質Leydig細胞標志物StAR和細胞增殖核抗原PCNA進行免疫熒光染色。石蠟切片常規脫蠟水化，檸檬酸鈉緩沖液(0.01 mol/L，pH=6.0)加熱修復抗原。封閉、PBST清洗后，用稀釋的上述蛋白一抗4℃孵育過夜。次日取出后清洗，CY3標記的熒光二抗室溫下避光孵育1 h，DAPI復染細胞核。熒光顯微鏡下觀察拍照。

每次實驗中，各組對每個指標分析5張切片。對于UCHL1、SOX9和PCNA，每張切片在隨機選取的5個視野中共計數25個生精小管橫截面中陽性細胞總數，取平均值作為單位小管中陽性細胞數；對于StAR，每張切片隨機選取5個視野，計數所有StAR陽性Leydig細胞簇(LC)的數目，除以視野中所有生精小管總數得到單位小管對應的Leydig細胞簇的數量。

5.原位細胞凋亡檢測：用羅氏的TUNEL熒光顯色試劑盒對睪丸組織中凋亡細胞進行檢測。石蠟切片常規脫蠟水化，蛋白酶K處理15 min，清洗后加50 μl的TUNEL反應工作液，避光37℃孵育1 h，清洗，DAPI復染，水性封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察，計數TUNEL反應陽性的細胞。每張切片隨機選擇5個視野(×200)，共計數500個細胞，凋亡指數(AI)=凋亡細胞數/500×100%。每組分析5張切片，共進行3次獨立重復實驗。

三、統計學分析

結 果

一、大鼠睪丸組織形態學結果

1. 各組睪丸組織的形態學特點：未冷凍的睪丸組織切片(對照組)可見生精小管排列緊密，管周間隙較小。小管內的精原細胞和支持細胞形態結構清晰可辨，排列整齊。睪丸間質中可見成簇分布的完整Leydig細胞群，小淋巴管和小血管結構完整(圖1)。

玻璃化凍融后的睪丸組織與對照組相比，形態結構有不同程度的改變(圖1)。A組凍融后的組織形態學改變最為明顯：生精上皮由于收縮和基底膜明顯分離，出現較大間隙。精原細胞和支持細胞形態尚可辨認，排列稍有紊亂，生精上皮的部分區域可見細胞脫落。睪丸間質改變相對較小，可見零散分布的Leydig細胞。B組的形態改變相對較小，生精上皮未從基底膜脫離。精原細胞和支持細胞排列整齊，較為緊密，細胞形態清晰可辨。生精小管管周沒有出現膠原增厚和纖維化現象。小管之間的間隙較對照組稍增寬。C組睪丸組織的生精上皮輕度收縮，生精上皮與基底膜偶見分離。精原細胞和支持細胞的形態區分比較困難，細胞排列稍紊亂。部分小管的生精上皮出現空泡，可見生精細胞脫落以及核固縮等病理改變。睪丸間質中小淋巴管和血管結構大量消失，完整的Leydig細胞簇較少。

Ctrl：對照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖1 不同濃度冷凍保護劑玻璃化凍存睪丸組織的形態學比較(HE染色，×400)

2. 各組睪丸組織形態學改變的半定量評分比較：各組的半定量評分結果如圖2所示，凍存組A、B、C評分均顯著高于對照組(P<0.05)。三組間，B組形態改變的評分最低，A組評分顯著高于B組和C組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05圖2 各組睪丸組織形態學改變半定量評分結果比較

二、大鼠睪丸組織中細胞特異性標志物及細胞增殖標志物表達的結果

1. 精原細胞標志物UCHL1熒光信號分布及陽性細胞數比較：UCHL1熒光信號主要分布在生精上皮基底室靠近基膜的精原細胞核中(圖3)。與未冷凍的對照組相比，玻璃化各組UCHL1陽性細胞數均有所下降，A、C組UCHL1陽性細胞數顯著減少(P<0.05)；冷凍組之間比較，B組的陽性細胞數最多，與C組比較差異具有統計學意義(P<0.05)(圖7)。

2.支持細胞標志物SOX9熒光信號分布及陽性細胞數比較：SOX9主要分布在生精上皮中精原細胞之間或偏內側，呈環形分布(圖4)。與對照組相比，A、C組的SOX9陽性細胞數顯著下降(P<0.05)，而B組與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)；凍存組之間比較，B組陽性細胞數較A、C組顯著增多(P<0.05)(圖7)。

3. 睪丸間質細胞標志物StAR熒光信號分布及陽性細胞數比較：StAR陽性染色主要定位在睪丸間質中的Leydig細胞內(圖5)。凍融后的睪丸間質中StAR表達減少，A、B、C組與對照組之間有顯著性差異(P<0.05)(圖7)。3個凍融組之間，B組熒光信號數量最多，而C組完整的LC簇數量最少(P<0.05)。

4.細胞增殖標志物PCNA熒光信號分布及陽性細胞數比較：PCNA主要分布在精原細胞等DNA復制較為活躍的細胞中，由于2周齡大鼠的睪丸發育尚未成熟，也有部分支持細胞處于有絲分裂階段，因此也有PCNA表達(圖6)。B組與對照組PCNA的表達量最為接近，二者之間無統計學差異(P>0.05)；A組和C組的熒光信號較對照組下降顯著(P<0.05)，但A、C組之間差異不大(P>0.05)(圖7)。

Ctrl：對照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖3 各組睪丸組織中UCHL1的表達(免疫熒光，×200)

Ctrl：對照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖4 各組睪丸組織中SOX9的表達(免疫熒光，×200)

Ctrl：對照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖5 各組睪丸組織中StAR的表達(免疫熒光，×200)

Ctrl：對照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖6 各組睪丸組織中PCNA的表達(免疫熒光×200)

注：與對照組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05圖7 各組睪丸組織中細胞標志物免疫熒光顯色統計結果

三、睪丸組織細胞凋亡檢測結果

未冷凍對照組的凋亡指數為(0.35±0.1)%，冷凍后睪丸組織中凋亡細胞數量明顯增加，A、B、C組的凋亡指數分別為(1.9±0.6)%、(1.2±0.2)%、(3.9±1.0)%，顯著高于對照組(P<0.05)；3個冷凍組之間，B組凋亡指數最低，顯著低于A、C組(P<0.05)(圖8)。

Ctrl：對照組；A：A組(7.5%DMSO+7.5%EG)；B：B組(15%DMSO+15%EG)；C：C組(25%DMSO+25%EG)圖8 各組睪丸組織TUNEL檢測結果

討 論

目前，臨床上對于包括睪丸組織凍存在內的新型生育力保存手段的需求越來越大[11]。對于罹患腫瘤、免疫性疾病等需要進行性腺毒性治療的患者，通過睪丸組織凍存幫助患者保留生育機會對提高患者家庭生活質量具有重要意義。

盡管睪丸組織凍存的相關研究已有一定時間，但無論是實驗室還是臨床上都尚無公認的標準程序。未成熟大鼠睪丸組織的玻璃化凍存效果在不同的實驗室有一定的差異。適宜濃度的冷凍保護劑是溶液玻璃化狀態形成的關鍵因素之一[12]，保護劑濃度過低無法提供足夠的保護效果，在降溫和升溫過程中會由于冰晶形成、氧化應激等理化因素造成細胞損傷。而當保護劑濃度過高時，不僅會由于滲透損傷效應破壞細胞質膜和細胞器，其化學毒性作用還會破壞細胞核DNA完整性、干擾生物合成和代謝，導致細胞增殖能力下降甚至凋亡[13]。

為了保證冷凍效率的同時降低單一成分滲透性保護劑濃度過高引起的毒性反應，一般選擇兩種及以上保護劑成分混合使用。DMSO作為滲透性冷凍保護劑單獨使用時，比EG、異丙醇、甘油等其他保護劑在冷凍過程中更能有效地保護組織結構和細胞活力[10]，但同時，過高濃度的DMSO會造成細胞內蛋白變性并誘導細胞凋亡[14]。EG分子量小，容易穿透細胞膜。由于其毒性較低，即使在濃度較高時細胞仍然可以耐受，因而在玻璃化冷凍中被廣泛應用[15]。已有較多證據支持采用DMSO和EG的組合對睪丸組織進行冷凍可以獲得較為滿意的凍存效果[16]，但該組合在玻璃化凍存中的適宜濃度還缺乏詳細的論證。

本研究參考既往人和小鼠未成熟睪丸組織玻璃化凍存的相關研究[17-18]，將使用較多的15%(DMSO/EG)作為中間濃度，低濃度組和高濃度組分別設置為7.5%(DMSO/EG)和25%(DMSO/EG)，分析不同濃度保護劑處理的組織凍存后在結構和功能表型等方面的差異。形態學結果顯示15%(DMSO/EG)組結構保存較好，而7.5%(DMSO/EG)組的生精小管結構有明顯損傷。滲透性冷凍保護劑充分置換胞內水分是實現快速降溫時玻璃化狀態的形成的必要條件，A組溶液中保護劑濃度較低，可能對水分的置換不充分，導致溶液在降溫過程中不能完全玻璃化或在復溫過程中出現再結晶。胞內產生的冰晶會破壞細胞結構，降低細胞活性和功能；胞外產生的冰晶則會破壞組織層次間的粘附和連接，引起生精細胞脫落、上皮與基底膜間空隙形成[17，19]。

UCHL1是泛素羧基端水解酶家族成員，在發育時期睪丸中的精原細胞內特異性高表達，敲除UCHL1的小鼠精原細胞無法正常發育。SOX9是性別決定相關的重要轉錄因子，在睪丸中主要在支持細胞中表達，調控支持細胞分化，與垂體-性腺軸的功能維持密切相關。StAR是膽固醇在線粒體中轉運的關鍵因子，在睪丸中主要分布在Leydig細胞中，StAR正常表達對睪丸內分泌功能有重要意義。增殖細胞核抗原PCNA是真核細胞有絲分裂時復制復合體的核心成分，對DNA的復制和損傷修復起關鍵作用，可作為評價冷凍后細胞增殖潛力的標志物[20]。本研究的結果顯示玻璃化凍存組中B組的PCNA表達水平最高，可能意味著該濃度保護劑對凍融睪丸組織中精原及幼稚支持細胞的增殖能力維持較為有利。既往研究表明，較高濃度的冷凍保護劑更容易形成良好的玻璃化狀態[21]。本研究中，B組的細胞標志物表達和細胞增殖能力在3組中最高，提示15%(DMSO/ EG)保護劑可以在凍融過程中相對較好地維持細胞的生理功能。高濃度C組的形態結構改變比低濃度A組小，但細胞標志物和功能指標的變化趨勢卻與之相反，且凋亡比例在3組中最高，我們推測這是由于C組25%(DMSO/EG)冷凍保護劑濃度過高，其化學毒性超出了細胞的承受范圍，在平衡過程中造成細胞內蛋白變性失活以及部分細胞凋亡。

本研究的濃度分組數量有限，組間濃度差梯度較大，未來可以嘗試進一步縮小組間濃度差，以探索更適合未成熟睪丸組織的冷凍保護劑濃度方案。DMSO對大鼠精原細胞冷凍保存較為有利，而EG對精母細胞保存更為有利，并且未成熟和成熟睪丸組織對保護劑的耐受性可能存在差異[15]。因此，建議根據凍存目的和實驗對象的發育階段對凍存液中各組分的濃度進行調整，以提高對特定組織的保存效率。

綜上，我們認為冷凍保護劑的不同濃度對未成熟睪丸組織玻璃化凍存效果有顯著影響，15%DMSO+15%EG組合是適宜未成熟大鼠睪丸組織玻璃化凍存的保護劑濃度方案，同時，仍有必要針對特定使用對象進一步探索適宜的玻璃化方案，為臨床應用提供實驗證據和理論支持。