響應(yīng)面法優(yōu)化提取云南苦蕎黃酮工藝研究

蔣高華　蔡冰　彭興華　余家友　陳業(yè)高

摘要?[目的]建立優(yōu)化苦蕎黃酮的乙醇回流提取工藝。[方法]在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)影響苦蕎中總黃酮提取率的4個(gè)主要因素乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行研究。[結(jié)果]以Box-Behnken?中心組合設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，探索最佳試驗(yàn)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、提取溫度80?℃、時(shí)間?2.0?h、液料比?40∶1（mL∶g），在該條件下實(shí)際總黃酮含量為0.059?0?mg/g，提取率為2.9?%。[結(jié)論]該研究結(jié)果與回歸模型的預(yù)測(cè)值（0.059?2?mg/g）基本相符。

關(guān)鍵詞?苦蕎;黃酮;響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)?R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）16-0191-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.055

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study?on?Optimal?Extraction?of?Flavonoids?from?Tartary?Buckwheat?in?Yunnan?Province?by?Response?Surface?Methodology

JIANG?Gao?hua1，2，3，CAI?Bing2，PENG?Xing?hua2?et?al?（1.Key?Laboratory?of?Plant?Resources?and?Chemistry，The?Xinjiang?Technical?Institute?of?Physics?and?Chemistry，CAS，Urumqi，Xinjiang?830011;2.College?of?Resources?and?Environmental?Engineering，Yunnan?Vocational?Institute?of?Energy?Technology，Qujing，Yunnan?655001;3.University?of?Chinese?Academy?of?Sciences，Beijing?100190）

Abstract?[Objective]This?paper?established?the?optimization?of?buckwheat?ethanol?reflux?extraction?technology?of?flavonoids.[Method]On?the?basis?of?single?factor?experiment，using?response?surface?method?to?analyze?four?main?factors?influencing?flavone?extraction?yield?from?tartary?buckwheat：ethanol?volume?fraction，liquid?solid?ratio，extraction?time，extraction?temperature.[Result]With?Box?Behnken?central?composite?design?to?establish?mathematical?model，the?optimum?extraction?conditions?were：ethanol?45%，temperature?80℃，time?2.0?h，liquid?solid?ratio?40∶1?（mL∶g），under?this?condition?flavonoids?content?was?0.059?0?mg/g，extraction?rate?was?2.9%.[Conclusion]The?result?is?basically?consistent?with?the?predicted?value?（0.059?2?mg/g）?of?the?regression?model.

Key?words?Tartary?buckwheat;Flavone;Response?surface?methodology

苦蕎屬雙子葉蓼科蕎麥屬植物，耐寒、耐旱、耐酸、耐貧瘠，生長(zhǎng)周期短，在我國(guó)西南、北方種植廣泛，資源豐富[1]。《本草綱目》記載：苦蕎麥味苦、平、寒，有益氣力、續(xù)精神、利耳目、隆氣寬腸健胃的作用。苦蕎中含有極為豐富的總黃酮類物質(zhì)，是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的，主要是蘆丁、槲皮素等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮類化合物具有降血糖、降血脂、防癌、抗突變、增強(qiáng)免疫力、殺菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老等功能。苦蕎在醫(yī)藥、化妝品、保健品方面有廣闊的應(yīng)用前景，民間亦以食用苦蕎防治糖尿病、高血壓、高血脂等病[3]。苦蕎中富含總黃酮，可作為總黃酮的重要材料來(lái)源[4]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)苦蕎殼中總黃酮的提取和研究多使用正交試驗(yàn)法[5]。而采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝的研究報(bào)道不多[6-7]。

筆者采用響應(yīng)面法對(duì)苦蕎殼中總黃酮的提取方法和提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取條件，旨在為工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)苦蕎總黃酮提供理論依據(jù)，對(duì)充分、合理開(kāi)發(fā)利用苦蕎資源具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?原料。苦蕎麥采自云南省宣威市楊柳鄉(xiāng)克基村白草坪，干燥后粉碎，備用。

1.1.2?儀器和試劑。TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);超聲波清洗器;電子分析天平;電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋;全自動(dòng)鼓風(fēng)干燥箱。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（UV98%，上海金穗生物科技開(kāi)發(fā)有限公司;無(wú)水乙醇（AR.，國(guó)藥試劑）;亞硝酸鈉（AR.，國(guó)藥試劑）;硝酸鋁（AR.，國(guó)藥試劑）;氫氧化鈉（AR.，國(guó)藥試劑）。

1.2?方法

1.2.1?蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

準(zhǔn)確稱取120?℃烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20?mg，用70%乙醇溶解，定容至100?mL，得濃度為0.2?mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、3.0、6.0?、9.0、12.0?mL于50?mL棕色容量瓶中，加入5%NaNO?2溶液?1.5?mL，搖勻，放置6?min后加入10%Al（NO?3）?3溶液?1.5?mL，搖勻，放置6?min后加入4%NaOH溶液20?mL，再用70%乙醇定容，搖勻;以70%乙醇為空白參比，10?min后在波長(zhǎng)510?nm處測(cè)定吸光度值，得蘆丁含量（C，μg/mL）與吸光度（A）回歸方程：A=0.006?45×C-0.019，R2=0.998?3，線性關(guān)系良好。

1.2.2?黃酮的提取與測(cè)定。準(zhǔn)確稱取試驗(yàn)備用的苦蕎2.0?g，按設(shè)定好的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行苦蕎的乙醇回流提取，以充分溶解苦蕎麥中的黃酮類物質(zhì)。水浴鍋加熱回流后，停止加熱，常溫得浸提液，將每次試驗(yàn)所得浸提液轉(zhuǎn)入量筒中加入70%乙醇定容至刻度，得待測(cè)樣品溶液。以空白樣品為對(duì)照，在波長(zhǎng)510?nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程A=0.006?45×C-0.019推導(dǎo)樣品的黃酮濃度，計(jì)算樣品的黃酮提取率。

1.2.3?單因素試驗(yàn)。稱取多份2.0?g苦蕎，在乙醇回流提取情況下，分別對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察這4個(gè)因素對(duì)總黃酮收率的?影響。

1.2.4?響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響總黃酮提取率的4?個(gè)主要因素（浸提時(shí)間、浸提溫度、乙醇濃度、液料比），確定好水平范圍，做4因素3水平（表1）共30個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（6個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析試驗(yàn)[8]。

2?結(jié)果與分析

2.1?單因素試驗(yàn)

2.1.1?乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦蕎中總黃酮提取率的影響。

由圖1可以得出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，苦蕎中總黃酮提取率和含量也增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，其提取率和總黃酮含量達(dá)到最大，提取率為1.817?3%。當(dāng)乙醇濃度再增加時(shí)，其總黃酮提取率和含量下降，可能是由于此時(shí)隨著乙醇濃度的增大，總黃酮類化合物溶解度減少，同時(shí)一些醇溶性物質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些物質(zhì)同乙醇和水分子的結(jié)合，導(dǎo)致總黃酮類化合物的提取率下降，故選取40%乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.1.2?液料比對(duì)苦蕎中總黃酮提取率的影響。

由圖2可知，隨著液料比的增大，苦蕎中總黃酮提取率和含量逐漸上升;開(kāi)始液料比為10∶1時(shí)，可能是由于浸提溶劑較少而造成;當(dāng)液料比超過(guò)30∶1時(shí)，提取率和含量呈緩慢上升趨勢(shì);液料比為70∶1時(shí)，其提取率和總黃酮含量達(dá)到最大，提取率為?3.873?8%。出于節(jié)省溶劑的考慮，選取40∶1的液料比。

2.1.3?提取時(shí)間對(duì)苦蕎中總黃酮提取率的影響。

由圖3可知，提取時(shí)間在0.5～1.0?h，苦蕎中總黃酮提取率和含量的變化不是很明顯;當(dāng)提取時(shí)間為1.5和2.5?h，達(dá)到了比較好的效果;提取時(shí)間為1.5?h，提取率為0.739?2%;提取時(shí)間為?2.5?h，提取率為1.645?2%。但從提取工藝的時(shí)間和周期等角度考慮，試驗(yàn)選擇提取時(shí)間為2.0?h。

2.1.4?提取溫度對(duì)苦蕎中總黃酮提取率的影響。

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，苦蕎中總黃酮提取率和含量升高較快。可能的原因是總黃酮在乙醇中的溶解度隨著溫度的升高而增大，同時(shí)隨著溫度升高，提取液黏度減小，擴(kuò)散系數(shù)增加，使提取速度加快。但溫度過(guò)高，一方面使其中的活性成分容易破壞，雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)操作帶來(lái)不便，成本費(fèi)用增大;另一方面將造成溶劑損失。再則，溫度超過(guò)80?℃時(shí)，總黃酮提取率下降。綜合各個(gè)方面的因素，選擇提取溫度?為80?℃。

2.2?響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用?Design-Expert?8.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表2）進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。以苦蕎殼中總黃酮的含量（Y）為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用如下多元二次回歸方程表示：

Y=0.044+5.508E-003A+0.014B+5.567E-003C+1.692E-003D+2.125E-003AB+7.525E-003AC-0.014AD+?1.000E-003BC+2.475E-003BD+5.750E-004CD-?5.150E-003A2-7.937E-003B2-0.010C2

該模型的決定系數(shù)為0.850?1，表示有85.01%的數(shù)據(jù)可用該模型解釋，說(shuō)明方程可靠性較高。變異系數(shù)值越低，顯示試驗(yàn)穩(wěn)定性越好，該試驗(yàn)中變異系數(shù)值較低，為24.12%，說(shuō)明試驗(yàn)操作可信[9]。由方差分析表3可知，模型的（Prob>F）<0.01（極顯著），表明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，該方程是苦蕎中總黃酮含量與提取工藝參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型，能較好地起到預(yù)測(cè)作用;同時(shí)回歸方程失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很少。從表3還可以看出，二次項(xiàng)（C2）的P<0.01，表明苦蕎中總黃酮的含量影響達(dá)極顯著水平;二次項(xiàng)（B2和D2）的0.050.05（除AD項(xiàng)之外），表明苦蕎中總黃酮含量的影響不顯著。

由表3可知，該試驗(yàn)所選模型不同處理間差異較顯著，說(shuō)明回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，應(yīng)變量和自變量之間線性關(guān)系顯著，試驗(yàn)方法可靠。變異系數(shù)較小（CV為24.12%），說(shuō)明試驗(yàn)穩(wěn)定性較好。模型相關(guān)系數(shù)（R2）為0.850?1，說(shuō)明該模型可靠性較好。從回歸方程模擬因變量的方差分析可知，影響苦蕎中總黃酮含量的單因素大小排序依次為液料比（B）、提取時(shí)間（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（D）。

2.3?苦蕎中總黃酮提取的響應(yīng)面法分析與優(yōu)化

由圖5可見(jiàn)，總黃酮含量與液料比具有明顯的二次拋物線關(guān)系，在液料比40∶1～42∶1?附近出現(xiàn)峰值。在一定條件下，隨著液料比的增加，苦蕎中總黃酮的浸出量會(huì)明顯增加，到達(dá)峰值后，會(huì)開(kāi)始下降。

由圖6可見(jiàn)，響應(yīng)面開(kāi)口向下，隨著每個(gè)因素的增大，響應(yīng)值總黃酮含量也增大，當(dāng)總黃酮含量增大到極值后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的增大，總黃酮含量逐漸減小。該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。

由圖7可見(jiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮含量發(fā)生很小的變化;提取時(shí)間一定，總黃酮含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而逐漸變大，到達(dá)峰值后，開(kāi)始減少。這可能是由于隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，使得一些非總黃酮類物質(zhì)溶出，并和總黃酮類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)乙醇，使得總黃酮類物質(zhì)溶出量減少。

由圖8可見(jiàn)，總黃酮含量與乙醇體積分?jǐn)?shù)也呈明顯的二次拋物線關(guān)系，在46%～48%附近出現(xiàn)峰值。根據(jù)相似相溶原理，苦蕎中總黃酮極性與此范圍乙醇溶液的極性相當(dāng)，因此在這一體積分?jǐn)?shù)溶液中溶解性較好。總黃酮含量隨溫度的升高顯著增加，呈直線上升趨勢(shì)。

由圖9可見(jiàn)，總黃酮含量隨提取溫度的升高呈直線上升趨勢(shì)，隨液料比的增大呈先升高后下降的趨勢(shì)。在提取溫度最高時(shí)，總黃酮含量最大。

由圖10可見(jiàn)，總黃酮含量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的提高快速增加，在達(dá)到峰值以后，開(kāi)始快速下降。根據(jù)浸提動(dòng)力學(xué)理論，時(shí)間的延長(zhǎng)有助于總黃酮的充分?jǐn)U散溶出，同時(shí)溫度的升高使得分子解附和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)速度加快，從而提高了總黃酮的浸出速率和得率。故適當(dāng)延長(zhǎng)浸提時(shí)間和提高溫度有助于提高總黃酮的提取率和浸出量。

綜上所述，可直觀地反映各因素交互作用對(duì)總黃酮提取率和總黃酮含量的影響。圖中曲線越陡峭，表明該因子對(duì)苦蕎中總黃酮提取率的影響越大;反之，曲線越平滑，表明該因子對(duì)苦蕎中總黃酮得率的影響較小[10]。其中提取溫度（D）和提取時(shí)間（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）和提取溫度（D）對(duì)總黃酮的提取率的交互影響，表現(xiàn)為曲線較陡;而其他因素的交互影響，曲線表現(xiàn)的較為平滑。根據(jù)以上的數(shù)據(jù)分析表明，苦蕎中總黃酮含量的交互影響順序?yàn)锳D>CD>BC>AC>AB>BD。

3?結(jié)論

通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)的苦蕎中總黃酮提取的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)47%，提取溫度80?℃，提取時(shí)間2?h，料液比42∶1，在該條件下，苦蕎中總黃酮含量理論上可?達(dá)0.059?2?mg/g。

通過(guò)?Design-Expert?8.0軟件分析，對(duì)二次多項(xiàng)回歸方程模型得出的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的可行性，將苦蕎中總黃酮的提取條件在回歸方程得到的理論基礎(chǔ)上修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，提取溫度80?℃，液料比?40∶1，提取時(shí)間2.0?h，采用此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得苦蕎中總黃酮含量為0.059?0?mg/g，提取率為2.9%。說(shuō)明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)可靠，具有一定的實(shí)際應(yīng)用?價(jià)值。

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