類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的IgG N-糖基生物標(biāo)志物篩選①

李曰進(jìn) 劉華民 紀(jì) 龍 徐希柱 劉雪貞 馮 霞 王友信 李 棟 王 嵬

(山東第一醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，泰安271016)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、進(jìn)行性、自身免疫性疾病，以累及周身關(guān)節(jié)的滑膜炎導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫痛為主要表現(xiàn)[1]。其病程較長，致殘率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。RA在世界范圍內(nèi)的患病率已達(dá)2%，中國人群患病率已達(dá)1%，且女性較多見[3,4]。RA的發(fā)病機(jī)制目前尚未清楚，病因復(fù)雜，與遺傳易感性、環(huán)境因素、免疫異常、飲食習(xí)慣以及心理社會因素等有關(guān)[5-7]。

已有研究顯示，RA 與IgG糖鏈結(jié)構(gòu)異常有關(guān)，IgG Fc段連接的糖基結(jié)構(gòu)的微小變化可以影響Fc段的構(gòu)型，從而改變甚至逆轉(zhuǎn)IgG的分子功能[8]。如糖基末端增加唾液酸和半乳糖，IgG與Fc受體結(jié)合能力減弱，導(dǎo)致自身抗體性炎癥反應(yīng)減弱，調(diào)控IgG抗體的促炎功能轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡坠δ?IgGN-糖基缺少核心巖藻糖修飾，抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)增強(qiáng)，導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)生[9,10]。目前研究已經(jīng)證實(shí)，異常IgGN-糖基化水平與多種炎癥性和自身免疫性疾病存在關(guān)聯(lián)，可以作為疾病診斷或預(yù)后的分子生物標(biāo)志物[11-14]。本研究擬通過分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和正常人群組間血漿 IgGN-糖基水平差異，利用ROC曲線探討類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在糖基生物標(biāo)志物，為闡明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2014年中國唐山市冀東油田醫(yī)院體檢人群，納入研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有心血管、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液和癌癥等任何嚴(yán)重疾病的患者；②無個人信息和血液樣本。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：①晨僵至少持續(xù)1 h；②有3個或3個以上的關(guān)節(jié)同時腫脹或有積液；③掌指關(guān)節(jié)、近端指間關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)中至少有1個關(guān)節(jié)腫脹或有積液；④在二項(xiàng)所列舉的關(guān)節(jié)中，同時出現(xiàn)對稱性腫脹或積液的關(guān)節(jié)；⑤皮下類風(fēng)濕結(jié)節(jié)；⑥類風(fēng)濕因子陽性；⑦手和腕的后前位X線照片顯示有骨侵蝕或有明確的骨質(zhì)疏松。以上 1～4條必須持續(xù)出現(xiàn)至少6周或12周；具備4條或4條以上者，可診斷為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

共計納入318例研究對象，年齡10～73歲，平均為(47.12±8.43)歲，其中男性42例(13.21%)，女性276例(86.79%)。RA組123例(38.68%)，對照組195例(61.32%)；RA組平均年齡為(50.69±11.53)歲，對照組平均年齡為(44.86±4.40)歲；RA組男性18例(14.63%)，女性105例(85.37%)。

1.2方法

1.2.1樣本采集及處理方法 使用乙二胺四乙酸二鈉(Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)真空采血管采集研究對象晨起空腹肘部外周靜脈血液樣本5 ml用于N-糖基組學(xué)分析，立即置于冰盒中保存運(yùn)送。血液樣本在低溫離心機(jī)內(nèi)4℃ 3 000 r/min離心10 min，用移液器吸取上層血漿樣本，分裝于3個1.5 ml離心管，置于-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2糖基檢測方法 采用親水交互高效液相色譜-超高效液相色譜法(Hydrophilic interaction high performance liquid chromatography-ultra performance liquid chromatography，HILIC-UPLC)對血漿IgGN-糖基進(jìn)行定量檢測，該方法是一種基于96孔G蛋白單片板的高通量、自動分析技術(shù)。該方法的簡要流程為：①制備96孔板Protein G提取；②IgG分離；③IgG去糖基化；④糖鏈標(biāo)記及純化；⑤液相色譜與電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(LC-ESI-MS)檢測分析。最終得到24個不同的色譜峰,由于GP3相對峰下面積最小，故將GP3排除分析。在直接測得的24個色譜峰基礎(chǔ)上，根據(jù)文獻(xiàn)報道，計算糖基衍生結(jié)構(gòu)[15]。

2 結(jié)果

2.1IgGN-糖基直接測量指標(biāo)組間差異比較 如表1所示，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組和對照組中，GP4、GP8和GP14糖基峰的含量為最多，約占各組總糖基峰的50%。GP1、GP2、GP4-GP6、GP11、GP19、GP22和GP24均為RA組高于對照組(P均<0.05)；GP9、GP12-GP18和GP20為RA組低于對照組(P均<0.05)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2血漿IgGN-糖基與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)性 校正年齡和性別因素后，GP1、GP2、GP4-GP6、GP11、GP19和GP24均與RA疾病呈正相關(guān)(P均<0.05)；GP9、GP12-GP15、GP17、GP18和GP20均與RA疾病呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)；G0n(無半乳糖基化)和Gal-ratio(無半乳糖基化的糖基結(jié)構(gòu)所占比例)為RA疾病的危險因素，OR值分別為5.75(95%CI 3.71～8.92)和8.53(95%CI 4.86～14.95)；G1n(單半乳糖基化)和G2n(雙半乳糖基化)為RA疾病的保護(hù)因素，OR值分別為0.59(95%CI 0.45～0.77)和0.19(95%CI 0.12～0.29)；FtotalS1/FtotalS2和FS1/FS2均為RA疾病的保護(hù)因素，OR值分別為0.18(95%CI 0.11～0.29)和0.33(95%CI 0.23～0.47)(表2)。

表1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組和對照組IgGN-糖基水平差異比較

Tab.1 Comparison of IgGN-glycosylation levels between rheumatoid arthritis group and control group

IgG N-glycansStructureRheumatoid arthritis(n=123)x±sM(QR)Control(n=195)x±sM(QR)P valueGP10.16±0.090.14(0.11)0.07±0.030.06(0.04)<0.0011)GP20.82±0.470.70(0.68)0.50±0.250.43(0.30)<0.0011)GP423.69±7.4522.92(9.81)16.04±4.1515.51(5.22)<0.0011)GP50.20±0.070.18(0.06)0.15±0.060.13(0.04)<0.0011)GP65.14±1.205.09(1.68)4.05±0.983.93(1.22)<0.0011)GP70.51±0.220.44(0.25)0.47±0.200.45(0.23)0.2821)GP818.95±1.8218.98(2.35)18.89±1.6618.92(2.19)0.7542)GP98.94±1.408.73(2.07)9.26±1.299.23(1.69)0.0342)GP104.65±0.834.65(1.29)4.65±0.904.51(1.01)0.5841)GP110.58±0.130.56(0.15)0.51±0.110.49(0.14)<0.0011)GP121.08±0.610.91(0.78)1.51±0.691.43(0.91)<0.0011)GP130.28±0.070.28(0.08)0.31±0.720.30(0.08)<0.0011)GP1414.06±4.1513.98(5.64)19.79±3.3420.12(4.70)<0.0011)GP151.81±0.411.80(0.54)2.07±0.382.08(0.55)<0.0012)GP162.72±0.492.67(0.54)2.80±0.482.81(0.63)0.1642)GP171.01±0.270.96(0.35)1.11±0.331.06(0.42)0.0071)GP189.54±2.879.09(3.88)12.56±2.3912.60(4.06)<0.0012)GP191.69±0.481.60(0.48)1.36±0.231.35 (0.27)<0.0011)GP200.28±0.080.27(0.09)0.31±0.080.30 (0.10)0.0011)GP210.49±0.100.48(0.12)0.49±0.080.49 (0.08)0.3111)GP220.09±0.030.09(0.04)0.08±0.020.08 (0.02)0.0111)GP231.65±0.421.61(0.53)1.68±0.321.69 (0.40)0.1881)GP241.46±0.461.40(0.50)1.15±0.231.12 (0.31)<0.0011)

表2 血漿IgGN-糖基指標(biāo)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性

Tab.2 Correlation between plasma IgGN-glycosylation index and rheumatoid arthritis

IgG N-glycanscOR value(95%CI)aOR value(95%CI)PGP118.57(9.28-37.13)17.52(8.72-35.22)<0.0011)GP22.69(1.99-3.64)2.31(1.68-3.190<0.0011)GP45.53(3.66-8.35)5.18(3.36-8.00)<0.0011)GP52.31(1.67-3.20)2.03(1.47-2.8)<0.0011)GP62.95(2.19-3.97)2.54(1.84-3.49)<0.0011)GP90.78(0.62-0.98)0.74(0.58-0.95)0.0181)GP111.88(1.45-2.44)1.60(1.22-2.10)0.0011)GP120.45(0.34-0.61)0.51(0.38-0.70)<0.0011)GP130.63(0.48-0.83)0.67(0.50-0.88)0.0041)GP140.16(0.11-0.24)0.16(0.10-0.24)<0.0011)GP150.48(0.37-0.63)0.55(0.42-0.73)<0.0011)GP170.70(0.51-0.90)0.76(0.58-0.99)0.0421)GP180.26(0.19-0.37)0.29(0.21-0.42)<0.0011)GP193.31(2.31-4.74)2.78(1.94-3.99)<0.0011)GP200.68(0.53-0.87)0.77(0.59-1.00)0.0461)GP221.38(1.09-1.73)1.25(0.98-1.60)0.068GP243.02(2.16-4.22)2.59(1.84-3.64)<0.0011)GalactosylationG0n5.99(3.97-9.05)5.75(3.71-8.92)<0.0011)G1n0.57(0.44-0.74)0.59(0.45-0.77)<0.0011)G2n0.18(0.12-0.27)0.19(0.12-0.29)<0.0011)Gal-ratio8.82(5.21-14.93)8.53(4.86-14.95)<0.0011)SialylationFtotalS1/FtotalS20.16(0.10-0.25)0.18(0.11-0.29)<0.0011)FS1/FS20.28(0.19-0.39)0.33(0.23-0.47)<0.0011)FucosylationFntotal1.15(0.92-1.46)1.16(0.91-1.48)0.24Fn0.86(0.68-1.07)0.94(0.74-1.20)0.63

Note：cOR represents the odds ratio after unadjusted age and gender；aOR represents the odds ratio after adjusting for age and gender；1)P<0.05,the difference was statistically significant.

圖1 IgG N-糖基診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的ROC曲線圖Fig.1 ROC curve of IgG N-glycosylation for diagnosis of rheumatoid arthritisNote: A.ROC plot for the diagnosis of RA with a single glycan-based indicator；B.A graph of the combined diagnosis of RA with a glycosylation index.

2.3血漿IgGN-糖基生物標(biāo)志物篩選 與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的糖基指標(biāo)經(jīng)逐步回歸篩選后，模型最終納入4個變量(GP1、GP2、GP4和GP24)。單個IgGN-糖基指標(biāo)診斷RA的ROC曲線下面積分別為：GP1(AUC=0.880，95%CI 0.836～0.925)、GP2(AUC=0.759，95%CI 0.695～0.822)、GP4(AUC=0.840，95%CI 0.789～0.891)和GP24(AUC=0.772，95%CI 0.713～0.831)(圖1A)。糖基指標(biāo)聯(lián)合ROC曲線下面積AUC=0.919(95%CI 0.883～0.954)(圖1B)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，調(diào)整年齡和性別因素后，有16個糖基直接指標(biāo)與6個衍生指標(biāo)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組和對照組之間存在統(tǒng)計學(xué)差異。在16個糖基直接指標(biāo)中，相比于對照組，高水平的GP1、GP2、GP4、GP6和GP24能增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患病風(fēng)險，GP9、GP12、GP13、GP15、GP17、GP18和GP20是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)性因素。GP1、GP2、GP4和GP6是末端沒有半乳糖基化和唾液酸化修飾的糖基結(jié)構(gòu)，GP9、GP12、GP13及GP15是末端有半乳糖基化修飾的糖基結(jié)構(gòu)，GP17、GP18、GP20及GP24都是末端含有唾液酸化修飾的糖基結(jié)構(gòu)。因此，提示我們半乳糖基化及唾液酸化水平降低會增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患病風(fēng)險。在6個衍生指標(biāo)中，G0n(無半乳糖基化)和Gal-ratio(無半乳糖基化的糖基結(jié)構(gòu)所占比例)水平升高會增加RA患病風(fēng)險，G1n(單半乳糖基化)和G2n(雙半乳糖基化)水平降低會增加RA患病風(fēng)險；唾液酸化水平(FtotalS1/FtotalS2和FS1/FS2)降低會增加RA患病風(fēng)險。 本次研究發(fā)現(xiàn)，GP1、GP4、GP6、GP11、GP19及GP24糖基峰均在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中水平升高，雖然以上糖基峰均含有核心巖藻糖基結(jié)構(gòu)，然而相比于對照組，其他含有核心巖藻糖基結(jié)構(gòu)的糖基峰(GP14、GP15、GP18和GP20)以及不含核心巖藻糖基結(jié)構(gòu)的糖基峰(GP12、GP13)在RA患者中水平較低，因此尚不能得出核心巖藻糖基化水平升高或降低會增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患病風(fēng)險。

血漿IgGN-糖基的特定譜型可及時反映機(jī)體多種生理和病理改變，復(fù)雜的糖基標(biāo)志物能更好地描述機(jī)體狀態(tài)。已有研究表明，IgGN-糖基指標(biāo)較傳統(tǒng)生物標(biāo)志物有更高的靈敏度和特異度，可以提供更加準(zhǔn)確的疾病預(yù)測信息[14]。此次研究發(fā)現(xiàn)，單個糖基指標(biāo)GP1對RA的診斷效力最大(AUC=0.880，95%CI 0.836～0.925)；而糖基指標(biāo)聯(lián)合診斷效力可達(dá)0.923，因此我們認(rèn)為血漿IgGN-糖基有望作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷分子標(biāo)志物，有助于實(shí)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的早期預(yù)警，為進(jìn)一步探索糖基組學(xué)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期診斷提供理論基礎(chǔ)。