單寧酸對腎癌細胞生長的抑制作用及其機制①

王宏英 魏海峰 王衛芳 周曉晶 郭艷霞 米旭光 劉 磊 方艷秋

(長春中醫藥大學臨床醫學院，生物化學與分子生物學教研室，長春130021)

腎癌，又稱為腎細胞癌、腎腺癌，起源于泌尿小管上皮，腎癌約占成人惡性腫瘤的2%～3%，占成人腎臟惡性腫瘤的80%～90%。目前腎癌的治療主要依靠手術及化學藥物，化療藥物的作用主要是抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞分化，或啟動癌細胞凋亡。研究表明，自然界中一些含有酚類化合物的植物具有抗癌的特性[1-3]，并不斷有新的具有抗癌功效的酚類化合物被發現[4]。祖國傳統中醫藥在腫瘤防治上具有獨特的優勢，我國藥典上收載的單寧酸具有多方面的藥理活性，具有顯著的抗炎、抗氧化、降糖、降脂、抗腫瘤等作用[5-7]。本實驗發現單寧酸(Tannic acid,TA)能顯著抑制人腎癌細胞OS-RC-2的生長。實驗結果為TA作為新藥應用提供了有價值的資料。

1 材料與方法

1.1材料 人腎癌細胞OS-RC-2購自中國科學院上海生命科學研究院，CCK-8試劑盒購自日本同仁，ROS 試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒均購自北京碧云天生物技術公司，2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)、TA購自Sigma公司，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)及總超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，8-羥基脫氧鳥苷(8-Oxo-deoxyguanosine,8-OHdG)及細胞間黏附因子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)ELISA檢測試劑盒購自美國RND公司，β-actin、Bcl-2、Bax、和Caspase-3抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將腎癌細胞OS-RC-2置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規培養，隔日用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化傳代備用。

1.2.2CCK8法檢測細胞增殖 收集處于對數生長期的OS-RC-2細胞，制成單細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種到96孔板，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度TA(20、40、80和100 μmol/L)，置37℃培養箱作用48 h，同時設置空白調零組(不加細胞加入等量的雙蒸水)，以及陰性對照組(加細胞加入等量的雙蒸水)。藥物作用結束前1 h，各孔加入CCK-8溶液10 μl，繼續培養1 h，酶標儀測450 nm處OD值，實驗重復3 次。細胞存活率(%)=[(實驗組OD值-空白調零組OD值)/(對照組OD值-空白調零組OD值)]×100%。

1.2.3OS-RC-2細胞形態學觀察 按每孔5 000個數量將OS-RC-2細胞接種于24孔板中，培養24 h后，加入TA(40、80和100 μmol/L)，設空白對照組。繼續培養48 h，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 分別取對數生長期細胞，用胰酶消化并計數，OS-RC-2細胞按2×105個/ml將1 ml的細胞混懸液分別接種于6孔培養板中，24 h后，待細胞融合達80%左右時，給藥組使含TA量分別為40、80和100 μmol/L，并設置不含TA的對照組。將其置于CO2培養箱(37℃)培養24、48、72 h后，胰酶消化離心后，冷PBS洗滌細胞2次，然后加入1×結合緩沖液使細胞再次懸浮，并使細胞密度達1×106個/ml；分別移出100 μl(細胞數為1×105個)細胞懸液至多個5 ml培養管內；相應地加入5 μl V-FITC或PI輕微地渦動細胞并在避光溫箱(25℃)中孵育20 min，每管中添加400 μl的1× 結合緩沖液,用流式細胞儀在1 h內檢測。

1.2.5DCF法測定細胞內ROS 將OS-RC-2細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞。給予不同濃度的含TA(20、40和80 μmol/L)培養液，24 h后用PBS洗2次，并換上終濃度為25 μmol/L DCFH-DA，放置于37℃培養箱孵育30 min，孵育結束后，用PBS再洗滌2次，使用酶標儀檢測熒光、488 nm激發波長、525 nm發射波長。

1.2.6化學顯示法檢測抗氧化酶活性 細胞以1×106個/ml密度接種于六孔培養板，各組細胞經處理后，取細胞上清液測GSH-Px、SOD的活性，取細胞裂解液測MDA含量，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7ELISA法細胞上清中ICAM-1蛋白表達 細胞以1×106個/ml密度接種于六孔培養板，各組細胞經處理后24 h，取細胞上清液檢測ICAM-1蛋白表達水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.8Western blot法檢測凋亡相關蛋白的表達 接種OS-RC-2細胞5×105個/25 cm2培養瓶，分別加入 80 μmol/L TA，空白對照組加入基礎培養基，作用48 h。收集細胞，PBS 洗滌后用50 μl 1×SDS裂解。提取蛋白后測定濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉移到PVDF膜，2%BSA封閉過夜，加入β-actin、Bcl-2、Bax和Caspase-3 抗體，4℃ 孵育過夜。TBST漂洗3次，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，化學發光劑溫育后暗室顯影，膠片曝光拍照。計算機圖像分析軟件進行分析，以特異性條帶平均吸光度與面積的乘積來反映蛋白的表達水平。

2 結果

2.1TA對OS-RC-2細胞生長的抑制作用 TA可有效抑制OS-RC-2腎癌細胞增殖，呈顯著劑量效應關系，OS-RC-2細胞經不同濃度TA(20、40、80和100 μmol/L)作用48 h后，細胞存活率分別為81.4%、72.9%、61.3%和38.2%，與對照組相比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2.2TA對OS-RC-2細胞形態學的影響 倒置顯微鏡下觀察，不同濃度TA作用于OS-RC-2細胞48 h后，可見對照組細胞生長圓潤飽滿，輪廓清楚，細胞間接觸緊密。給藥組細胞隨藥物濃度升高細胞數量明顯減少，細胞的體積變小、細胞間接觸松散。細胞出現皺縮變形，部分細胞輪廓模糊，甚至碎裂、脫落。尤其是100 μmol/L TA組最為明顯，見圖1。

2.3TA對OS-RC-2細胞內ROS生成的影響 不同濃度的TA對OS-RC-2腎癌細胞內ROS的影響并不一致。與對照組比較，20、40 μmol/L組ROS產量明顯增多，與對照組相比差異具有顯著統計學意義(P<0.05)，40 μmol/L組ROS產量顯著多于20 μmol/L 組(P<0.05)；但80 μmol/L組ROS產量卻并無顯著增多，與對照組相比，未見差異具有顯著性統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖1 TA對OS-RC-2腎癌細胞形態學的影響Fig.1 Effect of TA on cell morphology of OS-RC-2 renal cell carcinomaNote: A.Negative control；B.40 μmol/L TA group；C.80 μmol/L TA group；D.100 μmol/L TA group.

2.4TA對OS-RC-2腎癌細胞凋亡的影響 在40、80和100 μmol/L 濃度的TA作用下，OS-RC-2細胞隨著藥物劑量的加大，作用時間的延長，凋亡細胞的百分率逐漸增加，與對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)，見表2。

2.5TA對OS-RC-2細胞中脂質過氧化產物及抗氧化酶活性的影響 實驗結果表明，腎癌細胞中MDA含量隨著TA濃度的增加而增加，而GSH-Px及SOD的活性逐漸降低，組間差異亦具有顯著性統計學意義，見表3。

2.6TA對OS-RC-2細胞培養上清中ICAM-1蛋白表達的影響 TA作用于OS-RC-2細胞24 h后，高劑量TA組細胞分泌ICAM-1蛋白水平呈下降趨勢，80和100 μmol/L TA組細胞分泌的ICAM-1蛋白水平分別為(887.49±19.26)pg/ml、(796.15±27.40)pg/ml，與空白對照組(1 025.33±23.47)pg/ml比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

GroupsConcentration(μmol/L)ROS(DCF value)Control036.16±4.26TA20 49.81±12.431)40 78.46±9.672)3)8041.52±10.08

Note：1)P<0.05，2)P<0.01 vs control group；3)P<0.05 vs 20 μmol/L TA group.

GroupsConcentration(μmol/L)Percentage of apoptotic cells(%)24 h48 h72 hControl03.26±0.546.54±0.419.65±0.57TA405.07±0.481)11.28±0.572)15.47±0.492)808.24±0.652)19.26±0.442)31.54±0.332)10013.71±0.492)28.11±0.562)53.47±0.422)

Note：1)P<0.05，2)P<0.01 vs control group.

GroupsConcentration(μmol/L)MDA(nmmol/g prot)GSH-Px(mg/g prot)SOD(U/g prot)Control05.28±0.64462.04±25.4739.59±0.94TA205.92±0.31432.58±18.4635.87±1.071)406.03±0.28403.29±9.491)29.52±1.712)3)807.17±0.491) 356.28±10.922)3)24.45±0.832)3)

Note：1)P<0.05，2)P<0.01 vs control group；3)P<0.05 vs 20 μmol/L TA group.

圖2 TA對OS-RC-2細胞內Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達的影響Fig.2 Effect of TA on expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in OS-RC-2 cellsNote: *.P<0.05，**.P<0.01 vs control group.

2.7TA對OS-RC-2細胞內Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達的影響 如圖2所示，80 μmol/L TA作用于OS-RC-2細胞48 h后，細胞核中Bcl-2蛋白表達明顯下調(P<0.05)；Bax蛋白及凋亡蛋白Caspase-3表達明顯上調(P<0.05)。

3 討論

TA在藥典上又稱鞣酸、鞣質、五倍子TA，是一類復雜的高分子多元酚類化合物，屬于水解類單寧。由于TA的分子量比較大，其成分在植物中相當復雜，往往同一植物內同時存在不同結構而性質相近的各種TA，加之其化學結構大多不穩定，給進一步分離提純帶來麻煩，限制了其作為中藥制劑的發展。在多數情況下，TA一般都作為雜質除去。近年來，由于天然有機化合物分離、精制技術的提高，藥理實驗動物模型不斷出現、逐漸成熟，大量研究不僅闡明了千余種新的TA化合物結構，而且發現TA具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多方面的藥理作用。近年來，關于TA的抗腫瘤作用的研究日益增多，例如Nie等[8]研究表明，TA可以作為天然脂肪酸合成酶(Fas)抑制劑，下調乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞Fas的表達，并誘導癌細胞凋亡；TA還可通過抑制JAK2/STAT3信號通路，參與誘導細胞G1期停滯及線粒體凋亡途徑，抑制牙齦癌細胞YD-38的增殖并促進凋亡[9]。此外，TA在癌癥化療中還具有一定的輔助作用，如其可以改善阿霉素的心臟毒性并增強其化療療效[10]，提示TA具有潛在的抗腫瘤作用，深入研究其藥理活性，將對惡性腫瘤的治療很有意義。本研究發現，TA對腎癌細胞OS-RC-2生長具有顯著的抑制作用，并可促進腫瘤細胞的凋亡，呈劑量、時間依賴性。為了探討其機制，首先檢測了TA對OS-RC-2細胞內ROS生成的影響，結果表明，與對照組比較，20 μmol/L及40 μmol/L組ROS產量明顯增多，與對照組相比差異具有顯著統計學意義。腫瘤細胞內ROS的含量處于一種非平衡狀態，是其調控腫瘤分化、凋亡的基礎。ROS對于腫瘤細胞信號通路的調控具有兩面性，一方面ROS可加快腫瘤細胞增殖、分化、血管生成和激活轉移相關的信號通路，促進腫瘤的發生、發展和轉移；另一方面，高濃度的ROS可誘導細胞凋亡，促進細胞衰老和抑制細胞周期。因此說ROS是腫瘤進展的雙刃劍。目前有些新型化療藥物的殺瘤機制即為誘導腫瘤內部產生高濃度ROS。但本研究中80 μmol/L組ROS產量卻并無顯著增多，推測可能與腎癌細胞大量死亡，導致總ROS產量下降有關。研究結果還表明，腎癌細胞中MDA含量隨著TA濃度的增加而增加，而抗氧化酶活性GSH-Px及SOD的活性逐漸降低。有類似的研究證實，TA能夠增加人白血病HL-60細胞內超氧化物水平，同時降低MDA水平，從而促進細胞凋亡和抑制細胞增殖[11]。因此通過本部分實驗可以推測，誘導腎癌細胞內ROS增多并調節抗氧化酶的活性可能是TA抑制腎癌細胞生長的機制之一。

ICAM-1是免疫蛋白超家族黏附分子，廣泛表達于單核細胞、淋巴細胞、血管內皮細胞和癌細胞表面，參與許多生理和病理過程中細胞間信號的傳導，包括腫瘤細胞的發生、發展和轉移[12]。本研究首次觀察了TA對腎癌細胞培養上清中ICAM-1蛋白表達的影響，結果表明TA可降低OS-RC-2細胞ICAM-1蛋白的分泌，推測TA可通過此機制減少細胞間接觸，防止細胞集聚從而抑制其增殖。在體內腫瘤的微環境中，此作用還可抑制炎細胞的積聚，抑制因炎細胞活化而誘導的腫瘤發生及發展。此外實驗結果還表明，TA 可下調OS-RC-2細胞核中Bcl-2蛋白表達，并上調Bax蛋白及凋亡蛋白Caspase-3的表達，推測單寧酸的抗腫瘤作用還包括靶向線粒體凋亡途徑來誘導腫瘤細胞發生凋亡。

綜上，癌癥是一種多因素誘導發生疾病，因此有必要尋找有效的多靶點治療方法。由于單寧酸抗腫瘤活性具有多靶點、多效應，可作用于癌癥發生、發展的多個階段，同時其毒副性較小，因此可作為化學增敏劑以克服一些化療藥物的耐藥性，以達到輔助治療的效果，從而為癌癥的臨床治療方案提供一定的理論依據，單寧酸在腎癌防治上無疑顯示出潛在的藥用價值。