MicroRNAs與胸腺細胞發育的研究進展①

胡 琳 冒 靈 劉士明 陳 超 徐 林

(貴州省基因檢測與治療特色重點實驗室，遵義醫科大學免疫學教研室，遵義563099)

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為22～24個核甘酸(nucleotide，nt)。成熟的miRNAs能夠和互補或部分互補的靶mRNA的3′末端非翻譯區(3′untranslationalregion,3′UTR)結合，在轉錄后水平促進靶mRNA降解或介導其翻譯抑制，從而發揮廣泛的生理調控功能[1]。在人類，目前報道有1 000多個miRNAs家族分子，參與調控細胞的發育分化、增殖、凋亡及腫瘤的發生、發展等重要的生物學進程。新近大量研究顯示miRNAs分子在胸腺細胞發育過程中發揮了重要調控作用，提示其在機體免疫系統發育中的重要性。

1 胸腺細胞發育基本過程

胸腺是人或其他哺乳類動物的中樞免疫器官，是免疫細胞發育、分化以及成熟的重要場所。T淋巴細胞(T-lymphocyte)，簡稱T細胞，其來源于骨髓或胚肝淋巴樣干細胞分化發育的早期T細胞系前體(Early T lineage precuesor,ETP)，在胸腺中進一步發育成熟，繼而遷移至外周免疫器官發揮其生物學功能[2-4]。T細胞在胸腺發育的過程中，基于CD4和CD8的差異性表達，其發育分化過程可分為三個階段，如圖1所示，早期T細胞表型為CD4-CD8-雙陰性(Double negative cell，DN)，主要在皮質區域分化；隨后，雙陰性T細胞分化為CD4+CD8+雙陽性細胞(Double positive cell，DP)，開始表達T細胞抗原受體(T cell receptor,TCR)，逐漸進入髓質，而后經陽性選擇獲得MHC限制性識別能力，經陰性選擇獲得對自身抗原的耐受性；最終發育為成熟的、僅表達CD4或CD8的單陽性(Single positive cell，SP)T細胞，然后遷出胸腺，經血流運輸至周圍淋巴器官或淋巴組織定居，并發揮相應的免疫功能。

2 miRNAs與胸腺細胞發育的關系

研究表明，T細胞成熟早期(DP階段)miRNAs總體水平的升高與細胞總RNA含量的增加相一致，提示其表達與胸腺細胞發育存在關聯[5]。Cobb等[6]進一步發現，在胸腺細胞發育早期(DN到DP階段)，條件性缺失T細胞中miRNAs生成所需的關鍵酶Dicer將導致αβT細胞數量減少(而γδT細胞不受影響)，從而使DP階段胸腺細胞數減少。此外，脾臟中CD4和CD8 SP T細胞數以及外周血中總CD3+T細胞數均減少[6,7]。然而，單個miRNAs在不同的胸腺細胞亞群(DN、DP、SP)中表現為動態變化[5,8]。并且，在胸腺細胞發育過程中單個miRNAs水平的增加與其靶基因的缺失呈負相關[5,8]。這些研究表明特定miRNAs分子參與了胸腺細胞的發育過程(圖2)。

2.1miRNA-181與胸腺細胞 在miR-181a 過表達小鼠模型中，外周循環的T細胞數量明顯下降，其中CD8+T細胞的下降達到90%[9]，這提示miR-181a在T細胞的發育中可能發揮著重要作用。Liu等[10]對miR-181a-1和miR-181c的功能分析表明，miR-181a-1在胸腺祖T細胞(pro-T)中過表達，能促進CD4-CD8-DN向CD4+CD8+DP細胞的發育，而miR-181c不具有這樣的功能，可能是miR-181a-1獨特的miRNA前體(pre-miRNA)莖環核苷酸序列決定了其功能的特異性。Neilson等[5]進一步研究發現，miR-181a在胸腺細胞發育的CD4+CD8+DP階段特異性富集；且miR-181a 能通過抑制B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)和CD69等的表達，進而影響它們協調參與CD4+CD8+DP的陽性選擇過程[11]。

圖1 胸腺細胞的發育過程Fig.1 Basic process of thymocyte developmentNote: Schematic representation showing the different cell surface markers expressed in key stages of T-cell development in mouse thymus,including DN,DP,and SP stages.BM,bone marrow.

TCR的敏感性對于T細胞的陽性和陰性選擇具有重要作用。Li等[12]研究證實，在成熟的T細胞中miR-181a表達上調后，T細胞對抗原肽的敏感性會隨之提高，同時增強細胞內鈣離子的外流和細胞因子IL-2的產生；而在未成熟T細胞中miR-181a表達下調則可降低T細胞對抗原肽的敏感性，同時可削弱胸腺細胞發育的陰性、陽性選擇；此外，miR-181a對T細胞敏感性的定量調節能使成熟T細胞將拮抗劑(抑制性抗原肽)識別為激動劑；接下來的研究發現，miR-181a能通過抑制酪氨酸和絲氨酸磷酸酶的表達，導致磷酸化中間產物的穩態提高，從而降低TCR的信號閾值，增強其敏感性；進一步的分析顯示，miR-181a下調了多種磷酸酶基因的表達；重要的是，miR-181a的高表達與未成熟T細胞的敏感性相關，這提示miR-181a在T細胞的發育過程中可能充當著抗原敏感性的內在“變阻器”。Ebert等[13]研究還發現，抑制miR-181a表達可促進T細胞與參加陽性選擇自身肽段的反應，從而導致T細胞的成熟，同時，miR-181a通過調節胸腺細胞TCR信號的閾值來防止中度親和力克隆的缺失，保證陽性選擇的順利進行。

2.2miRNA-150與胸腺細胞 人和小鼠的miRNA表達譜顯示，在T細胞成熟過程中，miR-150水平明顯上調[8,14]。Zhou等[15]研究進一步發現miR-150在胸腺細胞的CD4-CD8-DN階段低表達， 在CD4+CD8+DP階段和CD8+T細胞中適度表達，而在CD4+T細胞中則高表達，miR-150的這種動態變化提示其可能對胸腺細胞的發育具有調控作用。在miR-150轉基因小鼠中，miR-150的過度表達使得小鼠胸腺細胞的發育受阻，特別是DN3到DN4的發育受阻，最終導致CD4+T和CD8+T細胞數量減少[14]。在探討機制方面，研究者發現轉錄因子c-Myb (c-myeloblastosis) 是miR-150的一個重要靶分子，在未成熟T細胞中miR-150過表達時，c-Myb表達下調[14]。除c-Myb外，NOTCH 3也是miR-150的一個重要新靶分子，它是T細胞分化的主要調控因子，可使T細胞增殖和存活下降[8]。這些研究均表明miR-150在T細胞成熟過程中發揮了重要調控作用。

圖2 不同的miRNA分子在胸腺細胞發育過程中的作用Fig.2 Role of different miRNAs in thymocyte developmentNote: Schematic is shown for the role of several miRNAs in thymocyte development.These miRNAs are involved directly or indirectly in the regulation of crucial aspects of T-cell activation,proliferation,and differentiation as depicted.

還有研究顯示，miR-150也參與不同功能T細胞亞群的發育過程。如，不變的自然殺傷T(invariant nature killer T,iNKT)細胞是T淋巴細胞中獨特的亞群，它們表達恒定的TCRVα14、NK細胞的部分標識CD161(NK1.1)分子和NK細胞受體NKR-P1C。Zheng等[16]研究發現，在iNKT細胞成熟、活化過程中，miR-150表達上調；進一步研究發現，在miR-150敲除(Knock out,KO)小鼠模型中，胸腺中iNKT細胞的成熟受損；隨后的骨髓細胞過繼轉輸實驗也證實miR-150 KO可導致iNKT細胞成熟和功能發生變化。Bezman等[17]進一步利用miR-150過表達模型小鼠研究，亦得出了相似的結論。以上研究表明，miR-150在iNKT細胞的發育和功能中發揮著重要作用。然而，其是否也參與其他T細胞亞群發育還有待研究闡明。

2.3miRNA-146與胸腺細胞 正常生理狀態下，miR-146a在包括T細胞在內的多種免疫細胞中存在表達[18]。研究報道，在骨髓淋巴祖細胞發育的早期，miR-146a過表達可損害造血干/祖細胞的發育過程，最終導致外周血中CD4+T細胞數量減少[19]。此外，Krigin等[20]研究發現，miR-146a的表達水平在胸腺不同發育階段的胸腺細胞中存在差異。Li等[21]利用miR-146a過表達模型小鼠進一步研究發現，miR-146a過表達可促進T細胞增殖，減少T細胞凋亡。更重要的是，在這種模型小鼠中，產生中樞耐受的關鍵過程——胸腺細胞的陽性選擇被削弱，使得CD4+CD8+DP T細胞增多，而CD4+SP和CD8+SP T細胞減少。且CD8+SP T細胞的成熟過程亦被削弱，從而導致CD8+SP T細胞比CD4+SP T細胞丟失更嚴重。以上研究表明，miR-146a可通過骨髓淋巴祖細胞和胸腺細胞發育兩個環節來調控胸腺細胞的發育，然而其相關靶分子機制仍待深入研究。

2.4miRNA-17～92與胸腺細胞 MiR-17～92是由6個miRNA組成的簇(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1)。在骨髓中，miR-17～92在淋巴樣細胞中的過度表達可導致細胞過度增殖，進而影響淋巴樣細胞向胸腺的遷入，導致胸腺細胞的發育異常[22]。此外，Xiao等[22]構建了DN1 T細胞過表達miR-17～92的模型小鼠，發現該小鼠其外周T淋巴細胞的數量發生明顯改變，以CD4+T細胞的變化最為顯著，提示miR-17～92參與了胸腺細胞的發育過程。Regelin等[23]進一步利用miR-17～92Δ/Δ小鼠研究發現，缺乏miR-17～92的胸腺細胞，其早期發育過程嚴重缺陷，特別是DN向DP的分化過程受阻明顯。這些研究提示，miR-17～92對胸腺細胞的發育具有重要調控作用，可能與CD4+T細胞的發育更為相關。然而，其在胸腺細胞發育各階段中的確切作用及相關機制仍未闡明。

2.5miRNA-155與胸腺細胞 天然調節性T細胞(natural regulatory T cells，nTreg)是淋巴細胞在胸腺成熟過程中產生的CD4+T細胞，它表達CD25分子。這些細胞在胸腺發育成熟后經血流運輸至外周淋巴器官，發揮相應的免疫功能。研究發現，miR-155在nTreg細胞發育中發揮重要調控作用[24-26]。在miR-155 KO小鼠中，其胸腺和外周淋巴器官的nTreg細胞數量減少；不僅如此，miR-155缺乏的nTreg細胞增殖能力也明顯削弱[24,27]。IL-2是nTreg細胞發育和存活的關鍵因素[28-30]。進一步的研究發現，miR-155可通過增強nTreg對IL-2的敏感性，增加信號轉導和轉錄活化蛋白5(Signal transduction and activator of transcription 5,STAT5)信號途徑傳遞，從而促進nTreg細胞在胸腺和外周的存活和增殖[27]。有意思的是，Kohlhaas等[24]還發現叉頭蛋白3(Forkhead box protein 3，Foxp3)可調控nTreg中miR-155的表達。鑒于STAT5信號途徑在Foxp3表達中的重要性[31]，因此，我們推測miR-155、STAT5和Foxp3三者間形成調節環路，共同調控nTreg的發育過程。此外，Sánchez-Díaz等[32]研究還發現，C型凝集素相關途徑也可以通過miR-155的表達來調節nTreg的胸腺發育過程，提示miR-155分子參與nTreg胸腺發育過程的復雜性。

此外，新近研究還報道miR-155參與了iNKT細胞的胸腺發育過程。Burocchi等[33]利用miR-155過表達模型小鼠研究發現，miR-155過表達可使胸腺中iNKT細胞發育成熟障礙，表現為未成熟的iNKT細胞大量滯留于其在胸腺發育的第二階段(CD24lo

表1 與胸腺細胞發育相關的miRNAs和其靶分子及效應

Tab.1 miRNAs and their targets and effects in development of thymocytes

miRNATargetEffectsSpeciesReferencesmiR-181aPTPN22 DUSP5/6 SHP-2Increases TCR sensitivity,regulates positive selectionMouse[12,13]miR-150NOTCH3Regulates pre-TCR and NFκB signalingHuman[8]c-MybBlocks DN3 to DN4Mouse[14]miR-155SOCS1Promotes Treg survival and thymic developmentMouse[24,27]CD69Promotes Treg cell development and homeostasisMouse[32]ItkMediates TGFβ signaling in intestinal lamina propria T cellsHuman[40]No reportPromotes Th17 polarizationMouse[41]Ets1,ItkBlock the maturation of iNKT cellsMouse[33]miR-146aGimap4Impairs the positive selection during T cell development;Mouse[21]STAT1Inhibits IFNγ signaling in TregsMouse[42]miR-17～92IL-7RReduces cell survival of common lymphoid progenitors and thymocytes at the DNto DP transitionMouse[23]CREB1 TGFβRⅡ PTENInhibits formation of iTregsMouse[43]miR-4281Foxp3Accelerates the differentiation of human naive cells to induced Tregs (iTregs)Mouse[31]miR-142Cdkn1bControls the early and mature thymocyte proliferationMouse[34]miR-125bBmf KLF13Regulates HSC survival and promote lymphoid-fate decisions at the level of the HSCMouse[35]miR-205Forkhead-Box N1Promotes T cell developmentMouse[36]miR-223E2F1 MEF2C TOXContributes to the development of T cellsMouse[37]miR-133bTh-POKRegulates the differentiation of NKT17 cell in thymusMouse[38]miR-126IRS-1Regulates the development of CD4+ SP cellsMouse[39]miR-873Foxo1Facilitates the differentiation of CD4+ T cells into Th17 lineageHuman[44]miR-29aDkk Kremen2 sFRP2Promotes canonical Wnt signaling in osteoblastsHuman[45]miR-34Wnt1 Wnt3 β-cateninSuppresses canonical Wnt signaling in epithelial and breast cancer cellsHuman[46]miR-10aBcl-6Restrictes Treg cell differentiation into Th17 cellsMouse[47]

Note：PTPN22.Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 9;DUSP5/6.Dual specificity phosphatase 5/6;SHP-2.SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2;c-Myb.c-myeloblastosis;SOCS1.Suppressor of cytokine signaling 1;Itk.Interleukin-2 inducibile T-cell special kinase;Ets1.E26 transformation-specific factor-1;Gimap4.GTPase IMAP family member 4;STAT1.Signal transduction and activator of transcription 1;IL-7R.Interleukin-7 receptor;CREB1.cAMP responsive element binding protein 1;TGFβRⅡ.Transforming growth factor β receptorⅡ;PTEN.Phosphatase and tensin;Foxp3.Forkhead box protein 3;Cdkn1b.Cyclin dependent kinase inhibitor 1B;Bmf.Bcl2 modifying factor;KLF13.Kruppel-like factor 13;E2F1.E2F transcription factor 1;MEF2C.Myocyte-specific enhancer-binding factor-2C;TOX.Thymocyte selection associated high mobility group box;Th-POK.T helper-inducing POZ/Kruppel-like factor;IRS-1.Insulin receptor substrate 1;Foxo1.Forkhead box O1;Dkk.Dickkopf WNT signaling pathway inhibitor;Kremen2.Kringle containing transmembrane protein 2;sFRP2.secreted Frizzled-related protein 2;Wnt1.Wingless type 1;Wnt3.Wingless type 3;Bcl-6.B cell lymphoma-6.

CD44hiNK1.1-)，從而導致遷移至外周的iNKT細胞數量減少。進一步研究亦發現，在該模型小鼠的iNKT細胞成熟過程中，miR-155的兩個靶分子E26轉化特異因子1(E26 transformation-specific factor-1,Ets1)和白介素2 誘導T細胞特異激酶(Interleukin-2 inducibile T-cell special kinase,Itk)的表達下調。然而，確切的調控機制還有待闡明。

2.6其他miRNAs與胸腺細胞 除上述的miRNAs家族分子外，其他miRNAs成員也參與了胸腺細胞發育的調控過程(見表1)。如，miR-142是一種進化保守的miRNAs，可在造血組織中選擇性表達。Mildner等[34]研究表明，miR-142表達缺失可影響細胞的穩態。進一步地分析發現，miR-142為胸腺細胞前體發育和T細胞成熟所必須。miR-142缺乏可引起胸腺細胞前體的發育停滯，導致胸腺細胞增殖分化過程受損，細胞大量滯留在DP階段。再如，miR-125b在淋巴干細胞中的表達程度高于髓系干細胞和造血干細胞。這種高表達促進了淋巴細胞譜系的發育，并參與了造血干細胞的存活和淋巴平衡的維持[35]。又如，miR-205可通過調節叉頭盒N1(Forkhead box N1)和特定的趨化因子促進應激后的T細胞發育[36]。miR-223則可通過與原癌基因的協調作用，進一步調控T細胞的發育過程[37]。而miR-133b可通過調節T細胞輔助誘導POZ/Kruppel樣因子(T helper-inducing POZ/Kruppel-like factor,Th-POK)表達和樹突狀細胞信號來調控NKT17細胞在胸腺中的分化[38]。最近我們利用miR-126 KO模型小鼠研究也發現，miR-126 KO后，可通過上調其靶分子胰島素受體底物來調控胸腺CD4+SP T細胞的發育[39]，這些研究進一步顯示了miRNAs家族分子參與胸腺細胞發育過程的復雜性。

3 小結

近年來，一系列研究表明miRNAs分子在胸腺細胞發育過程中發揮了重要調控作用，涉及到骨髓中淋巴祖細胞發育，以及胸腺中胸腺細胞的DN/DP、陽性和陰性選擇等各階段的發育。然而，仍有許多科學問題有待進一步闡明。如，這些miRNAs分子在參與胸腺細胞不同階段發育的過程中確切相互關系如何，相關分子機制又如何，以及這些miRNAs分子的表達調控機制是怎樣的；特別是miRNAs參與胸腺細胞發育與臨床疾病發生之間的內在聯系，以及如何開展基于miRNAs分子的相關臨床疾病的免疫生物治療，等等。這些科學問題的后續闡明，不僅將極大提升人們對miRNAs生物學功能和胸腺細胞發育調節機理的認識，且對后續相關臨床疾病的免疫生物治療新策略開發也具有重要意義。