天麻超微粉細胞破壁率的測定

龍海林 蔡鴻飛 袁誠 李康強 楊陽 李秋林 李海波 許文東

[摘要]目的 探討天麻超微粉細胞破壁率的測定方法，評價超微粉碎后天麻粉末的細胞破碎程度。方法 采用顯微制片細胞計數法，以天麻粉末中的薄壁細胞為評價指標，確定天麻粉末質量與薄壁細胞數目的線性關系，通過對比天麻常規粉末與超微粉薄壁細胞的數量，計算天麻超微粉的細胞破壁率。結果 天麻粉末中薄壁細胞可清晰觀察并計數，薄壁細胞數目與粉末的質量成正相關，在3.8124～22.8744 mg范圍內線性關系良好，天麻粉末經超微粉碎后細胞已完全破碎，超微粉的細胞破壁率可達99%以上。結論 天麻粉末顯微制片細胞計數法測定天麻超微粉細胞破壁率具有可行性和科學性，能夠為評價超微粉的細胞破碎程度提供參考和依據。

[關鍵詞]天麻;超微粉碎;薄壁細胞;顯微計數;細胞破壁率

[中圖分類號] R917? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）7（c）-0020-04

[Abstract] Objective To explore the determining method of cell wall-broken rate of Gastrodia elata micropowde， and to evaluate the degree of cell breakage of Gastrodia elata micropowde. Methods The parenchyma cells in Gastrodia elata powder were taken as the evaluation index， the linear relationship between the quality of Gastrodia elata powder and the number of parenchyma cells was determined by microscopic cell counting method. By comparing the number of parenchyma cells of Gastrodia elata conventional powder with that of ultrafine powder， the cell wall-broken rate of ultrafine powder of Gastrodia elata was calculated. Results The parenchyma cells in Gastrodia elata powder could be clearly observed and counted， the number of parenchyma cells was positively correlated with the quality of Gastrodia elata powder， and the linear relationship was good in the range of 3.8124-22.8744 mg. The cells of Gastrodia elata powder have been completely broken after ultrafine comminution， the wall-broken rate of Gastrodia elata micropowder was over 99%. Conclusion It is feasible and scientific to determine the wall-broken rate of Gastrodia elata micropowder by microscopic cell counting method， and provide reference and basis for evaluating the degree of cell breakage of ultrafine powder.

[Key words] Gastrodia elata; Superfine pulverizing technique; Parenchyma cell; Microscopic count; Cell wall-broken rate

天麻始記載于《神農本草經》中，被列為上品，原名“赤箭”[1]，屬蘭科多年生草本植物的地下干燥根莖[2]，因莖赤如箭桿而得名，主產于陜西、云南、貴州等地，其主要成分為天麻素、天麻苷元等酚類化合物及甾醇、核苷、有機酸、多糖等[3]，其中天麻素和天麻苷元為天麻中主要的藥用活性成分[4]。天麻味甘辛，性平，歸肝經，具有息風止痙、平肝陽、祛風通絡之功，主治急慢性驚風、抽搐拘攣、破傷風、頭痛眩暈、半身不遂、肢體麻木、風濕痹痛等癥[5]，臨床應用非常廣泛。

超微粉碎技術是一門多學科交匯的現代科學技術，應用于較多領域，如材料、化工、醫藥等行業[6]。中藥材超微粉碎技術是在近代工業技術與中醫藥結合基礎上發展起來的“民生科技”，已有研究顯示超微粉碎技術在中醫藥領域中的應用[7]，中藥材超微粉碎技術可以使中藥材粉末更加細化。目前，我國可供中醫入藥的植物、動物已多達上萬種，其中植物藥占絕大比例[8]，由于植物源和動物源藥材的有效成分主要分布于細胞內和細胞間質，尤以細胞內為主，因此，如何最大限度釋放藥材活性成分涉及到破壞細胞壁的問題[9]。超微粉碎技術可達到細胞破碎的目的，使活性成分暴露在細胞外，從而更加容易被溶劑提取或被人體吸收，提高藥材的生物利用度。

不同中藥具有不同的顯微特征，細胞破壁率的測定方法也不同，天麻的顯微特征包括薄壁細胞、厚壁細胞、草酸鈣針晶、糊化多糖、導管等，其中薄壁細胞是天麻的主要組織細胞[10]，呈類多角形或長多角形，顯微鏡下易于觀察，且內部含有糊化多糖顆粒，適合作為檢測指標進行細胞破壁率的測定。目前還沒有關于天麻超微粉細胞破壁率測定文獻的報道，本研究采用顯微計數法測定天麻超微粉的細胞破壁率，旨在為后續天麻超微飲片的質量控制提供參考和依據。

1材料、儀器及試劑

1.1藥材

收集于西藏林芝波密縣，經廣州白云山漢方現代藥業有限公司按照2015版中國藥典檢測合格[2]。

1.2儀器

DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機（江陰市新安粉體設備有限公司）;BFM6型“貝利”振動式微粉機（濟南貝利粉技術工程有限公司）;XSP-35TV-1600X型靈峰光學顯微鏡（上饒靈峰光學儀器廠）;BT-2001型激光粒度分布儀（丹東百特儀器有限公司）。

1.3試劑

醋酸;甘油（廣州化學試劑廠）;水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）。

2方法與結果

2.1樣品制備

2.1.1粗粉制備? 天麻藥材500 g干燥至水分10%左右，粉碎成粗粉（30目），備用。

2.1.2超微粉制備? 取30目粗粉轉移至貝利振動式微粉機中進行超微粉碎20 min，得天麻超微粉，采用激光粒度分析儀檢測粒度，超微粉粒度分布D90為40.61 μm，備用。

2.2天麻粗粉細胞計數[11]

2.2.1天麻粉末及切片顯微制片? 精密稱取天麻粗粉（30目）3.1770 g，置于25 ml容量瓶中，粉末經稀鹽酸浸泡除去白色乳濁液后用蒸餾水洗滌，然后加入水合氯醛溶液定容至刻度，超聲處理5 min，使粉末均勻分散;將容量瓶置90℃水浴鍋中加熱10 min左右，使天麻粗粉透化完全，然后用移液槍吸取6份，分別為30 μl（相當于3.8124 mg粉末）、60 μl（相當于7.6248 mg粉末）、90 μl（相當于11.4372 mg粉末）、120 μl（相當于15.2496 mg粉末）、150 μl（相當于19.062 mg粉末）、180 μl（相當于22.8744 mg粉末），將其分別滴在載玻片上，將載玻片放在水浴鍋表面加熱，揮干溶劑后滴加醋酸甘油水，用蓋玻片壓平裝片（裝片時防止氣泡產生，使混懸液布滿整個蓋玻片，以不溢出為度），分別置于顯微鏡下觀察。天麻藥材水中浸泡5 h后用美工刀切取薄片，置載玻片上滴加水合氯醛溶液1～2滴，置酒精燈火焰上來回移動加熱，重復3次，用濾紙吸干殘余水合氯醛溶液，滴加醋酸甘油水溶液，用蓋玻片壓平裝片，置顯微鏡下觀察。

2.2.2天麻薄壁細胞計數? 從“2.1”下的天麻粗粉顯微特征圖（圖1）可以看出，天麻中最主要的細胞為薄壁細胞，薄壁細胞中含有大量的糊化多糖顆粒，另外還存在少量的厚壁細胞?！?.1”下的天麻超微粉（圖2）中除糊化多糖外，其他組織基本破碎，因此，選擇天麻中的主要細胞即薄壁細胞為特征性細胞進行計數。以1個視野為1個計數單位，觀察30、60、90、120、150、180 μl六個體積的天麻粗粉混懸液所制得載玻片中完整的薄壁細胞數目，每個載玻片取8個計數單位的平均值，具體見圖3，對應的細胞個數分別為16.875、26.125、31.125、36.875、38.500、40.000。

A.低倍鏡下天麻橫切面（100×）;B.高倍鏡下天麻粗粉中觀察到的薄壁細胞（400×）;C.高倍鏡下天麻粗粉中觀察到的厚壁細胞（400×）

A.天麻超微粉在低倍鏡下的整體特征（100×）;B.天麻超微粉在高倍鏡下觀察到的糊化多糖顆粒（400×）

2.3細胞數目與粉末質量相關標準曲線制定

以粗粉的稱樣量（X）為橫坐標，每個計數單位中薄壁細胞的個數（Y）為縱坐標，建立標準曲線，得線性回歸方程Y=1.1879X+15.733，r=0.9556，提示天麻粗粉中薄壁細胞個數在3.8124～22.8744 mg范圍內線性關系良好，可作為顯微特征計數指標（圖4）。

2.4天麻粗粉細胞計數方法學考察

2.4.1精密度考察? 精密稱取3.0038 g天麻粗粉，同“2.2.1”方法制片6份，分別觀察8個視野，相對標準偏差（RSD）為3.11%，提示本方法精密度良好。

2.4.2穩定性考察? 取“2.4.1”下樣品，室溫放置，分別于0、3、6、9、12 h在顯微鏡下觀察，RSD為7.45%，提示樣品混懸液在12 h內穩定。

2.4.3重復性考察? 取6份相同質量的同一批天麻粗粉，相同方法制片，于顯微鏡下觀察，薄壁細胞個數RSD為6.24%，提示本方法重復性良好。

2.5天麻超微粉破壁率測定

精密稱取天麻超微粉3.0175 g，加水合氯醛溶液定容，取60、90、120 μl混懸液，分別置于載玻片上，按照“2.2.1”的方法制片，于顯微鏡下觀察（圖2），分別觀察8個視野，計數3個體積混懸液中完整薄壁細胞的個數，然后根據線性回歸方程式Y=1.1879X+15.733計算3個體積混懸液對應天麻粗粉質量中薄壁細胞的個數;最后，根據天麻粗粉薄壁細胞數和超微粉薄壁細胞數目，按以下公式計算破壁率[12]：Y=（A-B）/A×100%，其中“Y”表示薄壁細胞破壁率，“A”表示天麻粗粉薄壁細胞個數;“B”表示天麻超微粉薄壁細胞個數，“W”表示天麻混懸液中粉末的質量，各項指標見表1。結果顯示，超微粉碎技術可以使天麻飲片的破壁率達到100%，以天麻薄壁細胞為計數指標，具有科學性、可行性。

3討論

由于超微粉碎技術的發展，中藥超微飲片隨之而誕生，其中天麻超微飲片已上市銷售。超微粉的制備是生產破壁飲片的重要環節，而細胞破壁率是評價超微粉質量的關鍵指標。目前，已有學者對丹參[13]、苦瓜[14]和鐵皮石斛[15-16]等植物的超微粉細胞破壁率測定進行了研究，參考以上幾種藥材細胞破壁率的測定方法，本文探討了天麻超微粉細胞破壁率的測定，旨在為評價超微粉的細胞破碎程度提供參考和依據。

天麻主要含薄壁細胞，并且薄壁細胞中可見大量的糊化多糖顆粒，可推測有效成分天麻素和天麻多糖主要存在于薄壁細胞中，因此，以薄壁細胞為超微粉碎指標性特征細胞，并以薄壁細胞的破壁率作為超微粉碎的評價指標具有科學性。

本實驗通過對比不同目數的天麻粗粉，發現30目的粗粉細胞完整度較高，且薄壁細胞成片存在，易于計數，但30目粗粉因顆粒較大，在制片時易產生氣泡，因此，需要在使用水合氯醛溶液透化前用適當稀鹽酸溶液處理，除去干擾顯微觀察的白色乳濁樣物質，并使顆粒軟化后易于擠壓制片，這是本實驗的一大發現。

本實驗首次對天麻超微粉進行破壁率測定，測定細胞破壁率的關鍵在于回歸方程的精確性和細胞計數的準確性，由于天麻中除了薄壁細胞外還含有少量的厚壁細胞，因此，在細胞計數前需充分透化天麻粉末，使顯微觀察時能更好地區分薄壁細胞和厚壁細胞。天麻粉末顯微制片透化方法后續還需廣大學者繼續改進，使天麻超微粉的破壁率測定更加精確，為天麻超微飲片的質量控制研究提供參考和依據。

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（收稿日期：2018-12-18? 本文編輯：祁海文）