廣棗提取物對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與的大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用

劉霞 廖梅香 范小娜

[摘要]目的 研究廣棗提取物（CAE）干預(yù)對酒精性肝病大鼠血脂代謝、肝細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法 將60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對照組（A組）、模型組（B組）、CAE低劑量組（C組）、CAE中劑量組（D組）、CAE高劑量組（E組）和陽性對照組（F組，益肝靈片），每組各10只。采用梯度濃度酒精、分次少量灌胃的方法建立大鼠慢性酒精性肝病模型，同時(shí)給予CAE保護(hù)。干預(yù)8周后測定各組的三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、游離脂肪酸（FFA）水平，觀察各組的肝細(xì)胞GRP78/Caspase3比值及凋亡情況。結(jié)果 B、C、D、E、F組的TG、TC、LDL-C、FFA水平均高于A組，B、C、D、E組的HDL-C水平均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）;F組與A組的HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;C、D、E、F組的TG、TC、FFA、LDL-C水平均低于B組，D、E、F組的HDL-C水平均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;C組與B組的HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。B組的肝細(xì)胞凋亡率顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;C、D、E組的肝細(xì)胞凋亡率均顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。B組的肝細(xì)胞GRP78/Caspase3比值顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;D、E組的肝細(xì)胞GRP78/Caspase3比值均顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;C組的肝細(xì)胞GRP78/Caspase3比值高于B組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。HE染色顯示CAE能明顯改善大鼠肝臟組織病變范圍與程度，使炎性細(xì)胞浸潤減少。結(jié)論 CAE保肝功效可能與其抗氧化活性和阻制ERS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]廣棗提取物;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;酒精性肝病;大鼠

[中圖分類號(hào)] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）7（c）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Choerospondias Axillaries extracts （CAE） intervention on blood lipid metabolism， hepatocyte apoptosis and endoplasmic reticulum stress （ERS）-related protein expression in rats with alcoholic liver disease. Methods Sixty male Wistar rats were randomly divided into normal control group （group A）， model group （group B）， CAE low dose group （group C）， CAE middle dose group （group D）， CAE high dose group （group E） and positive control group （group F， Yiganling Tablets）， 10 rats in each group. After 8 weeks of intervention， the levels of triglyceride （TG）， total cholesterol （TC）， low density lipoprotein cholesterol （LDL-C）， high density lipoprotein cholesterol （HDL-C）， and free fatty acid （FFA） were determined. The ratio of GRP78/Caspase3 and apoptosis in hepatocytes were observed. Results The levels of TG， TC， LDL-C and FFA in group B， C， D， E and F were higher than those in group A， and the levels of HDL-C in group B， C， D and E were lower than those in group A， with statistically significant differences （P<0.01 or P<0.05）. There was no significant difference in HDL-C level between group F and group A （P>0.05）. The levels of TG， TC， FFA and LDL-C in group C， D， E and F were lower than those in group B， the HDL-C levels in group D， E and F were higher than those in group B， and the differences were statistically significant （P<0.01）. There was no significant difference in HDL-C level between group C and group B （P>0.05）. The apoptosis rate of hepatocytes in group B was significantly higher than that in group A， and the difference was statistically significant （P<0.01）. The apoptotic rate of hepatocytes in group C， D and E was significantly lower than that in group B， and the differences were statistically significant （P<0.01）. The ratio of GRP78/Caspase3 of hepatocytes in group B was significantly lower than that in group A， and the difference was statistically significant （P<0.01）. The ratio of GRP78/Caspase3 of hepatocytes in group D and E was significantly higher than that in group B， and the difference was statistically significant （P<0.01）. The ratio of GRP78/Caspase3 of hepatocytes in group C was higher than that in group B， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. HE staining showed that CAE could significantly improve the range and extent of liver tissue lesions in rats， and reduce inflammatory cell infiltration. Conclusion The liver-protecting effect of CAE may be related to its antioxidant activity and inhibition of ERS-induced hepatocyte apoptosis.

[Key words] Choerospondias Axillaries extracts; Endoplasmic reticulum stress; Alcoholic liver disease; Rats

酒精性肝病（ALD）是由于長期大量飲酒而導(dǎo)致的肝臟病變。隨著社會(huì)對乙醇需求量的增加，ALD的發(fā)病率和死亡率大幅度提高[1-2]。其中，酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化是三種最常見的肝損傷，其經(jīng)常同時(shí)并存并相互轉(zhuǎn)化[3-5]。ALD嚴(yán)重危害人民健康，從豐富的中藥資源中，篩選、研制出對防治ALD有確切療效的藥物，并在臨床上推廣應(yīng)用，是學(xué)者們研究的焦點(diǎn)。中藥主要通過發(fā)揮其抗氧化作用和清除有害自由基來達(dá)到保肝作用[6-7]。各種中藥抗氧化劑可針對氧化刺激多個(gè)相關(guān)環(huán)節(jié)，發(fā)揮抗酒精性肝損害的作用。

本課題組前期研究工作揭示對酒精性肝損傷大鼠，廣棗提取物（CAE）起到了保護(hù)肝細(xì)胞免受自由基損傷的作用[8]，但具體作用機(jī)理還不是很明確，本研究以大鼠為對象制備酒精肝損傷模型，觀察CAE干預(yù)后的效果，并探討部分機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑

廣棗藥材（毫州市中藥飲片廠，批號(hào)：130426），經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥鑒定教研室程齊來教授鑒定;益肝靈片（廣州白云山制藥總廠，批號(hào)：4060001）;三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和游離脂肪酸（FFA）試劑盒（上海晨易生物科技有限公司）;鼠抗兔抗GRP78、Caspase3（美國Santa Cruz公司）;TUNEL凋亡原位檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）;無水乙醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.2材料

同批雄性Wistar大鼠60只，購于江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：（贛）2013-0031。

1.3模型構(gòu)建及給藥方案

將60只大鼠隨機(jī)分為正常對照組（A組）、模型組（B組）、CAE低劑量組（C組）、CAE中劑量組（D組）、CAE高劑量組（E組）和陽性對照組（F組），共計(jì)6組，每組各10只。除A組外，其他組自由飲用5%的乙醇3 d，第4天改為10%的乙醇，以后每隔1周增加2%，直至18%，然后在每周增加1%直至22%。B組從飲用22%的乙醇當(dāng)天開始，以54%乙醇灌胃，1.2 ml，3次/d，持續(xù)8周。C、D、E組乙醇灌胃同時(shí)，從飲用54%乙醇的當(dāng)天起，每天灌胃1次CAE，分別為0.3、0.6、1.2 g/kg，持續(xù)8周。F組將益肝靈片研磨之后溶于蒸餾水中按100 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)灌胃，灌胃方法和時(shí)間與B組相同。A組自由飲用自來水，用生理鹽水灌胃，灌胃方法和時(shí)間同上。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1生化指標(biāo)測試? 各組血液中的TG、TC、HDL-C、LDL-C及FFA含量使用全自動(dòng)生化分析儀檢測，以上各指標(biāo)測定均按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2肝組織病理學(xué)觀察? 將肝組織用10%的中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，HE染色，在光鏡下觀察肝組織病理學(xué)情況。肝組織病理學(xué)改變判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：正常肝細(xì)胞為陰性（-）;肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死為輕度（+）;肝細(xì)胞灶狀壞死為中度（++）;肝小葉<1/3肝細(xì)胞壞死為重度（+++）;肝小葉>1/3肝細(xì)胞壞死為極重度（++++）。

1.4.3 TUNEL法觀察肝細(xì)胞凋亡情況? TUNEL法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行規(guī)范操作。選取LEICA DMi8倒置熒光顯微鏡觀察，在高倍鏡下隨意選取5個(gè)視野，對大鼠肝臟內(nèi)的陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性率平均值。

1.4.4蛋白免疫印記（Western blot）檢測蛋白表達(dá)? 取100 mg肝組織，加入1 ml的RIPA和10 μl 100 mmol/L的甲苯基磺酰氟（PMSF）和10 μl的磷酸酶抑制劑后，用組織勻漿器勻漿、高速離心，將上清液轉(zhuǎn)移到無菌離心試管中，并于-20℃冰箱儲(chǔ)存。取肝組織裂解物，加入電泳緩沖液，電泳（5%濃縮膠90 V，12%分離膠110 V，非穩(wěn)態(tài)電流）持續(xù)時(shí)間約1.5 h。分離膠被轉(zhuǎn)移到膜（90 V，90 min），打開電轉(zhuǎn)儀，取出硝酸纖維素膜（NC），用去離子水沖洗，洗液平衡后用5%脫脂奶粉溶液室溫密閉30 min，再4℃過夜，滴加已稀釋好的GRP78、Caspase3抗體，放入4℃冰箱過夜，用PBS反復(fù)清洗膜，再滴加5 ml二抗工作液，37℃的條件下反應(yīng)約1 h，用吸水紙吸干膜上PBS，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，待完全浸泡后，置于膠片上，并覆上保鮮膜，置于X線暗箱內(nèi)，應(yīng)用凝膠電泳圖像分析軟件系統(tǒng)以膠片中灰度值的比值（蛋白質(zhì)帶中的灰度值/內(nèi)部參數(shù)β-action灰度值）表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況觀察

A組大鼠活動(dòng)、飲食正常，無死亡現(xiàn)象;B組大鼠經(jīng)乙醇灌胃后先處于興奮狀態(tài)，后續(xù)出現(xiàn)行動(dòng)不穩(wěn)、食量降低、四肢無力、嗜睡等現(xiàn)象;與B組比較，各干預(yù)組大鼠均有不同程度的改善。整個(gè)造模期間，A組無死亡，B、C、D組均有2只大鼠死亡，E組和F組各有1只大鼠死亡。

2.2各組大鼠血脂水平的比較

B、C、D、E、F組的TG、TC、LDL-C、FFA水平均高于A組，B、C、D、E組的HDL-C水平均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）;F組與A組的HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;C、D、E、F組的TG、TC、FFA、LDL-C水平均低于B組，D、E、F組的HDL-C水平均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;C組與B組的HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;其他各組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.3各組大鼠HE染色肝組織病理學(xué)觀察

光鏡下觀察：正常肝細(xì)胞（A組）呈放射狀排列，肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞大小正常，胞質(zhì)均勻分布。B組大鼠肝小葉和肝細(xì)胞索消失，肝細(xì)胞排列無序，胞漿空泡化、核淡染;脂肪融合大空泡的出現(xiàn)把胞核擠到一邊。同時(shí)，匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤。F組肝細(xì)胞輕度水腫，肝細(xì)胞形態(tài)基本規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤及脂肪變性程度明顯減輕。C組大鼠肝小葉內(nèi)可見彌漫性脂肪泡分布，細(xì)胞內(nèi)可見數(shù)量不等的脂滴，并伴有壞死和炎性細(xì)胞浸潤。D組肝細(xì)胞體積增加稍有減輕，細(xì)胞內(nèi)有少許脂肪空泡，伴有壞死和炎性細(xì)胞浸潤。E組大鼠肝小葉清晰，肝細(xì)胞索可見，脂肪空泡數(shù)目明顯減少，細(xì)胞變性壞死等現(xiàn)象基本消失。

2.4各組大鼠肝細(xì)胞凋亡率的比較

A組大鼠肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目極少。B組的肝細(xì)胞凋亡率顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;C、D、E組的肝細(xì)胞凋亡率均顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;其他各組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。隨著給藥劑量越大，凋亡指數(shù)下降趨勢越明顯（圖1）。

2.5各組大鼠肝組織GRP78/Caspase3比值的比較

B組的肝細(xì)胞GRP78/Caspase3比值顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;D、E組的肝細(xì)胞GRP78/Caspase3比值均顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;C組的肝細(xì)胞GRP78/Caspase3比值高于B組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;其他各組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

3討論

ALD發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，所涉及的致病因子有很多，除酒精及其代謝物的直接毒性損傷外，還包括過敏原的刺激、炎性介質(zhì)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡和免疫性損害等，其可結(jié)合起來共同誘導(dǎo)ALD[10-14]。肝細(xì)胞中含有大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，病毒性肝炎、中毒性肝損傷等多種肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）有密切的聯(lián)系[15-16]。由于ALD中，高同型半胱氨酸血癥可作為重要的應(yīng)激源通過引起氧化應(yīng)激來誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，因而，ERS在ALD發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到研究者的關(guān)注[17-20]。

本研究結(jié)果顯示，B、C、D、E、F組的TG、TC、LDL-C、FFA水平均高于A組，B、C、D、E組的HDL-C水平均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）;F組與A組的HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;C、D、E、F組的TG、TC、FFA、LDL-C水平均低于B組，D、E、F組的HDL-C水平均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;C組與B組的HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示酒精能導(dǎo)致體內(nèi)血酯水平異常，而CAE有一定程度的降脂功效，CAE能更有效地改善ALD大鼠脂代謝紊亂，加速了脂代謝，降低血清FFA水平。

采用Western blot檢測大鼠血清中的GRP78、Caspase3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果提示，B組的肝細(xì)胞GRP78/Caspase3比值顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;D、E組的肝細(xì)胞GRP78/Caspase3比值均顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;C組的肝細(xì)胞GRP78/Caspase3比值高于B組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。采用TUNEL技術(shù)觀察結(jié)果顯示，B組的肝細(xì)胞凋亡率顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;C、D、E組的肝細(xì)胞凋亡率均顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而且給藥劑量越大，凋亡指數(shù)下降趨勢越明顯，提示對于ALD大鼠經(jīng)CAE干預(yù)后可不同程度地抑制肝細(xì)胞凋亡指數(shù)的增高，且呈劑量依賴性。

綜上所述，CAE可能是通過阻制ERS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)正常肝細(xì)胞增殖，從而達(dá)到保肝的功效。

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（收稿日期：2019-01-21? 本文編輯：任秀蘭）