AM真菌結構及鑒定方法的研究進展

楊帆 曹涵銘 陳園園 王金龍

摘要? ? 叢枝菌根（AM）真菌是在自然界中廣泛分布于土壤的有益微生物。AM真菌鑒定是菌根研究的基礎，其對保護菌種多樣性，促進AM真菌在農業生產上應用具有重要意義。本文總結了AM真菌的結構特征、國內外在其形態學和分子生物學的鑒定方法，旨在為AM真菌的多樣性調查和更加精準地開展AM真菌鑒定工作提供參考。

關鍵詞? ? 叢枝菌根（AM）真菌;多樣性;結構;鑒定方法

中圖分類號? ? S154.3? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）16-0152-03? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? Arbuscular mycorrhizal（AM） fungi are beneficial microorganisms that widely distribut in the soil in nature. Identification of AM fungi is the basis of mycorrhiza research，and it is of great significance to protect the diversity of strains and promote the application of AM fungi in agricultural production. This paper summarized the structural characteristics of AM fungi，and its morphological and molecular biology methods at home and abroad，in order to provide reference investigation for the diversity of AM fungi and more accurate identification of AM fungi.

Key words? ? arbusular mycorrhizal fungi;diversity;structure;identification method

我國自然資源豐富，植物種類多樣。叢枝菌根（AM）真菌能與包括被子植物、裸子植物、苔蘚、地衣[1]以及已發現的90%的維管束植物形成共生體，并影響其生長發育。因此，AM真菌是一種寶貴的微生物資源，AM真菌的菌絲體在細胞內的形態是泡囊狀和叢枝狀，所以AM真菌又被稱為泡囊-叢枝菌根，即VA菌根[2]。

叢枝菌根真菌是一種普遍存在于自然生態系統與農田生態系統中的真菌，能與大多數陸生植物根系形成互惠共生體系的微生物。AM真菌具有專性活體營養的特性，目前還不能進行分離提純培養，其寄生對宿主沒有特異性選擇[3]，只進行無性繁殖。

1? ? AM真菌的功能及結構

1.1? ? AM真菌的功能

菌根是土壤中的菌根真菌與寄主植物營養根系相結合形成的互惠共生體，和菌根共同形成的真菌稱為菌根真菌。這種共生現象是寄主植物將自身光合同化的有機物或碳水化合物供給自身生長發育的同時還提供給菌根真菌生長;此外，菌根真菌的菌絲體交叉生長形成網絡結構，大面積地接觸寄主植物根系周圍的土壤，有助于吸收土壤中更多的養分，增強了寄主植物根系對礦質營養和水分的吸收[4]。AM真菌的功能主要受以下3個因素的影響，分別為菌絲在土壤中的密度、活性及其分布狀態[5]。

除了十字花科、蓼科、莎草科、莧科、石竹科等10余科植物外[6]，叢枝菌根真菌幾乎能和所有的綠肥作物、果樹、蔬菜、經濟作物形成互惠共生體[2]。研究初期關于陸地生態環境的特征表明，水生低等植物向陸生高等植物進化的過程，AM真菌的作用是必不可少的;在惡劣的生態環境中，菌根植物則是發展的重點，非菌根植物的存活率極低[6]。

AM真菌功能具有多樣性，主要體現在以下8個方面：①植物根系土壤周圍有很多不能被植物吸收的礦質元素，植物不能得到足夠的營養，而AM真菌可以有效獲取并利用土壤中移動性差的元素，幫助植物有效吸收利用;②土壤中的微生物存在很多傳染性病原，單一的植株很難抵抗這些病原物，而AM真菌能有效抵抗病原微生物的傳播，因而接種了AM真菌的植株抵抗土壤中傳染性病原微生物的能力有所提高;③提高植物對非生物脅迫的抗性，如干旱、鹽漬、重金屬毒害等;④與根際微生物協同促進植物固氮、或加速土壤中氮磷化合物或有機污染物的形態轉化;⑤AM真菌能提升生態系統凈生產力的主要原因是自身合成球囊霉或相關蛋白;⑥AM真菌通過菌絲直接纏繞土壤以及菌絲分泌的其他物質對土壤的黏結，促進土壤水穩性團聚體的形成，參與了土壤演變過程;⑦作物群落的生物多樣性、群落的穩定性的相關變化，歸結于AM真菌與植物群落相互作用的程度，是否直接與群落產生作用;⑧不同群落的植物被地下的菌絲網絡侵染，將會形成一個龐大的菌落，不再出現單一植株，同時通過菌絲網絡傳遞植物間所需的營養成分[7]。因此，AM真菌可以作為植物的生物肥料、生物防護劑、生物農藥、生物促進劑等[8-10]，其在農田生態系統中的應用性很強并且有廣闊的前景。

1.2? ? AM真菌的結構及作用

根據菌根菌絲與寄主植物根細胞的關系，科學家將其分為外生菌根、內生菌根和內外兼生菌根。外生菌根是指菌根菌絲只會侵入到幼嫩寄主植物根細胞的皮層，不會進入細胞侵染，在細胞的間隙形成一種哈蒂氏網，根外形成菌套;內生菌根是菌根菌絲會透過寄主植物根的細胞壁，進入到表皮或根部皮層細胞進行侵染，長在細胞間隙的菌絲[11]形成叢枝狀的分枝，叢枝菌根是內生菌根中沒有隔膜的一類[3];內外兼生菌絲則兼顧了內生菌根和外生菌根的形態特征以及生理特性。由圖1可知，叢枝菌根包括泡囊、叢枝、胞間菌絲等結構[12]。

1.2.1? ? 根外菌絲。菌根真菌的根外菌絲是分布在土壤基質中的真菌菌絲體，其菌絲體在寄主植物根外分枝伸展，發達時可在植株根際周邊形成松散的菌絲網絡系統。根據菌絲形態結構可分為2類，一類是厚壁菌絲，細胞壁厚且菌絲不分隔，多核，直徑20～30 μm;另一類是薄壁菌絲，起源于厚壁菌絲的棱角狀突起，直徑2～7 μm，能穿透土壤中有機物顆粒吸收營養物質和水分[6]。

1.2.2? ? 根內菌絲。根部細胞內部的菌絲稱為根內菌絲，可分為胞內菌絲和胞間菌絲。胞內菌絲就是指菌絲從一個細胞直接進入另一個細胞體內沿著根系縱向生長的一類菌絲體。胞間菌絲指生長在細胞間隙的菌絲，在叢枝菌根真菌侵染植物根系時可以經常看到[3]。

1.2.3? ? 侵入點。侵入點是叢枝菌根真菌菌絲穿透并侵入根內的位點。當菌絲與根表皮接觸時，根表皮就會形成一個類似附著胞的結構，是菌絲進入根系內的通道。一般來說，每毫米根系侵入點的數量是1～25個，其數量主要取決于植物種類、真菌種類及土壤特性的差異。因此，單位根系長度侵入點的數量可作為評價叢枝菌根真菌侵染程度大小的指標之一[3]。

1.2.4? ? 叢枝。叢枝是菌根菌絲侵入寄主植物根細胞后，連續快速分枝形成的一種枝狀結構。一般來說，叢枝出現在菌根侵染初期階段，維持2～3周后重新消亡或分枝。含有叢枝的細胞內有大量小液泡，其中有許多0.1～0.2 μm的聚磷酸鹽。叢枝是養分吸收和交換的重要場所[13]，叢枝的豐富度與產生速率，被作為體現菌根共生體中功能菌根的數量及真菌的代謝和功能潛力的標志[14]。

1.2.5? ? 泡囊。泡囊多為圓形、橢圓形或方形囊狀結構，由宿主皮層細胞或細胞內菌絲末端或中部膨大而成。不同的叢枝菌根真菌具有不同的泡囊形態。Glomus真菌的泡囊一般是橢圓形且無梗的，而Acaulospora、Entrophospora和Kuklo-spora真菌的泡囊與之不同，后者表面常有凹陷[15]。并非所有AM真菌都產生大量泡囊，Archaeospora、Intraspora、Paraglo-mus和Scutellospora極少形成泡囊。所以泡囊是AM真菌形態學鑒定指標之一。泡囊的功能一是貯藏養分，其內貯藏大量油狀內含物，是貯藏器官;二是隨受損組織進入土中起繁殖體的作用[6，11]。

1.2.6? ? 孢子和孢子果。孢子和孢子果是叢枝菌根真菌繁殖的重要器官，著生在根外菌絲上，分布于土壤中，一般為圓形或橢圓形，內含儲藏性脂肪和碳水化合物[13]。孢子和孢子果的大小、形狀、顏色以及胞壁的結構是菌根分類學的重要依據之一。

2? ? AM真菌的分類

1885年德國植物生理學家森林學家Frank首次提出“菌根”。AM真菌的多樣性主要表現在分子水平、形態學水平和生態學水平上[5]。國際叢枝菌根保藏中心做了大量工作，并對Morton和Benny的分類系統進行修正[16]。歐洲菌藏中心（BEG）已登記保藏了10科多屬種菌株，并保藏了部分菌種的基因序列，為AM真菌的形態學鑒定提供了重要的檢索對照依據[17]。目前，共有1個綱，4個目，8個科，10個屬（表1）[18]。

據估計，AM真菌已經在世界存在逾4.6億年，Schü？覻ler等[19-20]對AM真菌的18S rDNA基因進行分析后，結果顯示，AM真菌與接合菌門、擔子菌門以及子囊菌門有共同的起源[21]，所以科學家將AM真菌歸屬為球囊菌門（Glomer-omycota），AM真菌屬于球囊菌門、球囊菌綱，目前已分離鑒定了200余種[22]。

3? ? AM真菌的鑒定方法

3.1? ? 形態學鑒定方法

AM真菌形態學的鑒定主要觀察以下3個特征：孢子、孢子果以及孢子壁的各個形態，但孢子及孢子果主要依附于被侵染物根系周圍的土壤中。

特定種類的染色劑如Melzer試劑、棉藍試劑可與部分AM真菌孢子壁層發生特異性反應，真菌種類不同反應特征也不同，因而這種通過觀察反應差異的形態學鑒定方法可作為AM真菌鑒定的輔助方法。通過濕篩傾析法從土壤中篩選出一些孢子，觀察（體式顯微鏡）其生長發育基本特征、孢子聚集方式、孢子果內的排列方式，然后通過Olympus顯微鏡觀察測定孢子的形態結構特征進行分類鑒定[23]。

3.2? ? 分子生物學鑒定方法

AM真菌的分子生物學鑒定主要根據不同類的核糖體DNA排列順序不同，得到特異引物來對AM真菌做到基因水平的精確分類。DNA提取一般采用CTAB法。由于PCR技術特異性強、靈敏度高、操作簡單、速度快，可以較全面地建立AM真菌的DNA克隆文庫。

rDNA具有高度保守性，根據這一特性可設計完成具有種間高度特異性的PCR引物[3]。高等級水平生物群體間的系統分析可利用18S、5.8S和28S rDNA基因組成的一個轉錄單元[24]，該轉錄單元間隔區為內轉錄間隔區（ITS）。ITS的特點為在AM真菌種間表現多種變異，而在同種不同株間表現高度保守性，這一特性可為AM真菌的分類鑒定提供豐富的遺傳信息[25]。18S rRNA基因克隆文庫構建是目前研究AM真菌多樣性較為理想的方法，該基因克隆庫的構建可以準確地揭示土壤環境、植物根系的AM真菌多樣性。目前常用檢測AM真菌多樣性的方法如下。

3.2.1? ? 聚合酶鏈式反應（PCR）。聚合酶鏈式反應（PCR）是PCR技術依賴DNA聚合酶的酶促反應，在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下進行，其特異性由根據rDNA設計的引物和模板DNA的特異性結合決定，因為rDNA在同源物種的進化上是高度保守的，而間隔區序列存在種間差異[3]。可從AM真菌孢子中提取DNA，用PCR擴增，根據DNA模板和引物結合的特異性，通過電泳擴增分離片段，比較不同AM真菌擴增產物的差異[26]。

3.2.2? ? 隨機擴增多態性（RAPD）。隨機擴增多態性（RAPD）是利用一種隨機合成的隨機排列的單寡核苷酸引物，通過PCR反應擴增靶細胞DNA。不同菌株間的基因組可能存在重組、插入或缺失導致的基因序列的改變，擴增的產物通過電泳分析獲得電泳圖譜，進而分析DNA片段數量和長度的多態性。RAPD使用的是隨機引物，不用提前知道目的基因及其相應的序列，但這可能導致生物個體某一特殊DNA片段得不到有效擴增[27];RAPD操作簡便，試驗周期短，能在較短時間內篩選大量樣品;RAPD標記可以覆蓋包括編碼區和非編碼區整個基因組，反映整個基因組的變化[3]，是一項很有價值的分子標記技術。

3.2.3? ? 變性梯度凝膠電泳（DGGE）。變性梯度凝膠電泳（DGGE）是對16S rDNA基因上不同序列的DNA解旋所需的不同變性劑的溫度和濃度，可分離某一個不同堿基的雙鏈DNA片段的分子電泳技術[28]。分子生物學鑒定中，能快速分離鑒定大量樣品，既可以分析不同微生物群落的差異，也可以研究同一個微生物群落隨時間和外部環境壓力的變化過程[29]，但是DGGE圖譜只顯示群落豐富度，不能確定具體AM真菌菌種。

3.2.4? ? 限制性片段長度多態性（RFLP）。限制性片段長度多態性（RFLP）是一種利用放射性同位素標記或非放射性同位素標記的探針與轉移在固相膜上的基因組DNA進行雜交，得到不同多態性的限制性消化片段以用來分析DNA[30]。根據被AM真菌侵染的寄主根系的ITS序列和18S rRNA基因片段設計特定引物，PCR和RFLP可用于鑒定AM真菌[30]。可分析編碼特定基因的基因區域，也可用來鑒定種群內和種群間各個體的差異[31]。RFLP建立在PCR基礎上，所以不用分離培養，而且該法可檢測到環境中所有的菌，包括活菌（可培養的和不可培養的）和未降解的死菌[32]。在研究夏季洪水對AM真菌數量的影響時，用ITS-RFLP技術分析AM真菌孢子的基因組特征[33]。相關學者[34]用ITS-PCR/RFLP技術分析了AM真菌結構的多樣性。RFLP是一種對DNA序列分析的簡化，可進行親緣關系較近的鑒定。

3.2.5? ? 磷酸脂肪酸（AFLP）測定技術。磷酸脂肪酸（AFLP）測定技術是一項基于PCR和RFLP相結合的技術，這項技術根據磷脂脂肪酸分子的結構不同，選擇擴增基因組DNA限制性酶切片段，可進行特異性分子標記。RFLA對內切酶要求高，用量少，沒有復等位基因，靈敏度高，但操作要求嚴格，擴散時多發假陽性、凝膠背景雜亂等諸多問題，使該技術在一定程度上存在局限性[17]。

3.2.6? ? 高通量測序技術。高通量測序技術是利用芯片進行測序，可以在數百萬個點上同時閱讀測序。此外，因為樣品中某種DNA被測序的次數反映了樣品中該DNA的豐富度，所以有精確的定量功能[35]。高通量測序技術能更準確地揭示微生物群落、多樣性及生物地理學的變化[36]，極大地降低了測序成本，同時也實現了大規模土壤微生物的直接測序[37]。

3.3? ? 2種方法的優缺點

形態學鑒定有不一致性、局限性和偶然性[5]，基本只能鑒定到種，更多的取決于鑒定者經驗，容易丟失不產生孢子的種類。這需要鑒定者對已發現真菌以及新紀錄種的形態特征有足夠的了解[17]。同時，有些孢子形態又極其相似，很難客觀全面地對AM真菌做出評價，低估了 AM真菌物種多樣性，又因為AM真菌孢子易受環境影響，在特定季節或環境下，某些產生孢子多的AM真菌可能會被認為是優勢種，但當環境發生變化時他們可能會停止產生孢子[36]。

雖然分子生物學可以克服這一局限，但也存在自身局限性。分子生物學方法鑒定在DNA提取時，易受微生物區系、真菌結構以及生育期的影響，導致檢測結果不準確，而且檢測樣本來源于田間，非無菌培養，真菌DNA在擴增過程中易被污染[38]。目前，分子生物學方法鑒定更有科學性，但仍需不斷完善。

4? ? 參考文獻

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