改則縣2個(gè)牦牛遺傳資源群體評(píng)估

巴多 扎西多吉 次旦卓瑪 歐珠 平措占堆洛桑達(dá)瓦 朱彥賓 孫光明 洛 桑 達(dá)娃央拉 次旦央吉 巴桑旺堆 尼瑪次仁 洛桑頓珠 益西吐登 周全

摘要? ? 本研究利用18對(duì)微衛(wèi)星對(duì)改則縣的16頭本地牦牛和18頭半野血牦牛進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估。結(jié)果顯示，18對(duì)微衛(wèi)星的平均等位基因數(shù)為7.44，其中TGLA73、BM2113和BGR3012等3個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度最高，為1.000 0，AGLA293位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度最小，為0.204 9。改則縣本地牦牛的期望雜合度（HE±SD=0.700 0±0.042 2）、觀測(cè)雜合度（HO±SD=0.724 3±0.027 0）、平均等位基因數(shù)（NA=6.22±2.86）以及多態(tài)信息含量（PIC=0.636）均要高于改則縣半野血牦牛（HE±SD=0.686 4±0.039 4，HO±SD=0.694 0±0.026 5，NA=6.06±2.44，PIC=0.622）。2個(gè)群體之間的遺傳分化指數(shù)FST=-0.005 42，同時(shí)結(jié)合主成分分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)群體遺傳分化不明顯。

關(guān)鍵詞? ? 微衛(wèi)星;遺傳多樣性;半野血牦牛;西藏改則

中圖分類號(hào)? ? S823? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）16-0173-03? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? Using 18 microsatellites，genetic diversity assessment of 16 local yak and 18 half-wild yak from Gaize County was studied.The results showed that the average number of alleles of 18 pairs of microsatellites was 7.44.The observed heterozygosity of the three loci（TGLA73，BM2113 and BGR3012）was highest（1.000 0），and the smallest observed heterozygosity of AGLA293 was 0.2049.The expected heterozygosity（HE±SD=0.700 0±0.042 2），observed heterozygosity（HO±SD=0.724 3±0.027 0），average allele number（NA=6.22±2.86）and polymorphic information content（PIC=0.636）of the local domestic yak were higher than those of the semi-wild blood yak respectly（HE±SD=0.686 4±0.039 4，HO±SD=0.694 0±0.026 5，NA=6.06±2.44，PIC=0.622）.The genetic differentiation index FST=-0.005 42 between the other two populations，combined with principal component analysis，it is found that the genetic differentiation of the two populations was not obvious.

Key words? ? microsatellite;genetic diversity;semi-wild blood yak;Gaize Tibet

改則縣隸屬西藏自治區(qū)，地處西藏西北部、阿里地區(qū)的東部、藏北高原腹地。東與那曲地區(qū)的雙湖、尼瑪縣相接，東南與措勤縣相連，南與日喀則市的仲巴縣毗鄰，西與革吉縣、日土縣接壤，北以昆侖山為界與新疆維吾爾自治區(qū)交界。東西長450 km，南北寬670 km，總面積13.56萬km2，是阿里地區(qū)面積最大的一個(gè)純牧業(yè)縣，約占阿里地區(qū)總面積的1/3。

微衛(wèi)星是20世紀(jì)80年代后期開發(fā)的分子標(biāo)記。微衛(wèi)星廣泛分布在整個(gè)基因組中，富含多態(tài)性，高分辨率，相對(duì)高度保守，共顯性，易于檢測(cè)和重現(xiàn)[1-3]。微衛(wèi)星技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于豬[4-7]、牛[8-12]和羊[13-16]的遺傳資源鑒定工作中。微衛(wèi)星標(biāo)記在牦牛中也得到了應(yīng)用，例如，羅 輝等[17]和蔡 欣等[18]分別利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記研究了麥洼牦牛的遺傳多樣性;鐘金城等[19]利用微衛(wèi)星分析標(biāo)記對(duì)麥洼牦牛、九龍牦牛、大通牦牛、天祝白牦牛的遺傳多樣性及其分類進(jìn)行研究;毛永江等[20]利用微衛(wèi)星標(biāo)記和血液蛋白基因坐標(biāo)記方法研究青海高原牦牛內(nèi)的遺傳多樣性;張浩[21]利用微衛(wèi)星對(duì)甘肅省天祝縣的5個(gè)天祝白牦牛群體進(jìn)行了近交系數(shù)的研究;李 鐸等[22]利用微衛(wèi)星DNA研究了西藏11個(gè)牦牛類群的遺傳多樣性及類群間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記從DNA水平上對(duì)改則縣的本地牦牛和半野血牦牛進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估，為評(píng)價(jià)、保護(hù)和利用改則縣的牦牛遺傳資源提供理論依據(jù)。

1? ? 材料與方法

選擇改則縣本地牦牛16頭和半野血牦牛18頭（表1），采集靜脈血，帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ没蚪MDNA提取試劑盒（DP304，天根生化科技有限公司）提取全血中的基因組DNA，-20 ℃保存。

參考聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和國際動(dòng)物遺傳學(xué)會(huì)（ISAG）聯(lián)合推薦的引物，本研究選取了其中18對(duì)SSR引物，并在引物序列上游5′端加上FAM等熒光標(biāo)記，以便檢測(cè)。將引物進(jìn)行組合擴(kuò)增，并對(duì)PCR過程進(jìn)行優(yōu)化，熒光標(biāo)記，獲得PCR產(chǎn)物。所用引物和片段大小見表2。采用20 μL PCR反應(yīng)體系，其中各組分的終濃度分別為dNTPs 0.2 mmol/L、Mg2+1.5 mmol/L、混合上下游引物0.5 mmol/L、Taq酶5 U/μL、DNA模板1 μL（約60 ng）。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)過35個(gè)循環(huán);于72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。PCR產(chǎn)物用ABI 3130 xl全自動(dòng)基因分析儀進(jìn)行分型檢測(cè)。

利用以下軟件分析數(shù)據(jù)：Microsatellite Toolkit軟件[23]計(jì)算各遺傳位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Number of alleles，NA）、多態(tài)信息含量（Polymorphic information content，PIC）、觀察雜合度（Ob-served Heterozygosity，HO）和期望雜合度（Expected He-terozygosity，HE）等參數(shù);Arlequin 3.5軟件[24]計(jì)算物種內(nèi)群體間遺傳分化指數(shù)（FST）;GENEPOP 3.4軟件[25]進(jìn)行哈德溫伯格平衡檢驗(yàn)（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）;Fstat 2.9軟件[26]計(jì)算群體近交系數(shù)（FIS）;主成分分析（PCA）利用R語言腳本分析。

2? ? 結(jié)果與分析

由表3可知，就位點(diǎn)而言，18個(gè)微衛(wèi)星中AGLA293位點(diǎn)的期望雜合度（HE=0.193 7）、觀測(cè)雜合度（HO=0.204 9）以及多態(tài)信息含量（PIC=0.177 9）均是最小的。TGLA122位點(diǎn)的期望雜合度（HE=0.912 5）最大;有3個(gè)位點(diǎn)（TGLA73、BM-2113和BGR3012）的觀測(cè)雜合度最大，為1.000 0;TGLA122位點(diǎn)的PIC值最大，為0.868 8。18個(gè)微衛(wèi)星中平均發(fā)現(xiàn)了7.44個(gè)等位基因數(shù)，等位基因數(shù)范圍3（BM2113）～14（TGLA-122）。18個(gè)微衛(wèi)星中只有6個(gè)位點(diǎn)在這2個(gè)牦牛群體中偏離了哈代溫伯格平衡，其中SPS115和BGR3020位點(diǎn)只在一個(gè)牦牛群體中偏離了哈代溫伯格平衡，MGTG7、BM2113、BGR3019和BGR3012這4個(gè)位點(diǎn)在2個(gè)牦牛群體中均偏離了哈代溫伯格平衡。

在2個(gè)改則縣牦牛群體的34個(gè)個(gè)體的18個(gè)微衛(wèi)星中共發(fā)現(xiàn)了134個(gè)等位基因數(shù)，平均等位基因數(shù)為7.44。本研究選取的18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，BGR3011位點(diǎn)為中度多態(tài)，AGLA293位點(diǎn)為低度多態(tài)，其余16個(gè)位點(diǎn)均為高度多態(tài)。說明2個(gè)牦牛群體遺傳多樣性水平較高，均有足夠的基因資源存在于牦牛群體內(nèi)。并且18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有10個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度大于期望雜合度，其中有3個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度為1.000 0，這也說明了2個(gè)牦牛群體中的遺傳多樣性水平較高。

就群體而言，改則縣本地牦牛內(nèi)的期望雜合度（HE±SD=0.700 0±0.042 2）、觀測(cè)雜合度（HO±SD =0.724 3±0.027 0）、平均等位基因數(shù)（NA=6.22±2.86）以及多態(tài)信息含量（PIC=0.636）均要高于改則縣半野血牦牛（HE±SD=0.686 4±0.039 4，HO±SD=0.694 0±0.026 5，NA=6.06±2.44，PIC=0.622），2個(gè)群體的觀測(cè)雜合度均要高于期望雜合度。近交系數(shù)在2個(gè)群體中均為負(fù)值，說明這2個(gè)牦牛群體均表現(xiàn)為雜合子過度。2個(gè)牦牛群體中都各有5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離了哈代溫伯格平衡。然而根據(jù)遺傳多樣性各項(xiàng)參數(shù)綜合考量，這2個(gè)群體遺傳多樣性尚表現(xiàn)豐富，暗示2個(gè)群體保種情況良好，具有進(jìn)一步開發(fā)利用的潛力。

此外，改則縣本地牦牛品種與半野血牦牛之間的的多樣性指標(biāo)數(shù)值相差不大，說明2個(gè)群體之間差異性可能很小（表4），進(jìn)一步計(jì)算2個(gè)群體間間遺傳分歧（FST值），結(jié)果顯示FST值為-0.005 42，差異不顯著（P>0.05），進(jìn)一步表明了2個(gè)群體間的差異性較小。同時(shí)PCA分析結(jié)果（圖1）顯示，2個(gè)群體存在大量個(gè)體間表現(xiàn)高度親緣相近，這可能暗示了由于兩者棲息地較近，在放牧過程中可能存在頻繁的基因交流，或認(rèn)為的串換種畜所致[27]。

3? ? 結(jié)論

評(píng)估結(jié)果表明，改則縣2個(gè)牦牛群體中的遺傳多樣性水平較高，且遺傳分化不明顯。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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