星星草類萌發(fā)素蛋白基因（PutGLP2）的克隆及生物信息學(xué)分析

傅文上 李波 戴紹軍 李瑩

摘要? ? 類萌發(fā)素蛋白是一類種子萌發(fā)相關(guān)的特異性標(biāo)記，其在植物生物和非生物脅迫應(yīng)答過程中起到了重要作用。本研究通過酵母cDNA文庫篩選，獲得全長為1 065 bp的PutGLP2基因，其5′非翻譯區(qū)164 bp，開放讀碼框666 bp，編碼221個氨基酸，3′非翻譯區(qū)235 bp。利用PCR技術(shù)，克隆獲得PutGLP2的ORF序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PutGLP2在氨基端（N端）具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域及N端信號肽，預(yù)測定位于細(xì)胞壁或胞外間質(zhì)。將PutGLP2與水稻的43種GLP蛋白進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)PutGLP2屬于類萌發(fā)素亞家族2成員之一，并與水稻OsGLP1-1相似性最高。本研究將為豐富植物類萌發(fā)素蛋白基因信息提供參考。

關(guān)鍵詞? ? 星星草;類萌發(fā)素蛋白;基因克隆;生物信息學(xué)分析

中圖分類號? ? Q943.2? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）16-0179-02? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Abstract? ? Germin-like proteins are a class of specific marker associated with seed germination，which play an important role in the response of biotic and abiotic stress.In this study，a full-length 1 065 bp PutGLP2 gene was isolated through screening from yeast cDNA library，The 5′-untranslated region was 164 bp，the open reading frame was 666 bp，encoding 221 amino acids，and the 3′-untranslated region was 235 bp.The ORF sequence of PutGLP2 was cloned by PCR.Bioinformatics analysis revealed that PutGLP2 has a transmembrane domain and a signal peptide at the amino terminus（N-terminus），which is predicted to be localized to the cell wall or extracellular matrix.Phylogenetic tree analysis of PutGLP2 and 43 GLP proteins in rice revealed that PutGLP2 is a member of the germin-like protein subfamily 2 and has the highest similarity with rice OsGLP1-1.This study will provide a reference for enriching the plant germination protein gene information.

Key words? ? Puccinellia tenuiflora;germin-like protein;gene cloning;bioinformatics analysis

植物萌發(fā)素蛋白（Germin）是種子萌發(fā)的特異性標(biāo)記之一。1980年Thompson等首次在萌發(fā)的小麥種子克隆獲得該基因[1]。類萌發(fā)素蛋白（Germin-like protein，GLP）是與萌發(fā)素蛋白序列相似性較高的一類位于胞外基質(zhì)的可溶性蛋白。它具有一個β桶狀（cupin）結(jié)構(gòu)，屬于cupin超家族[2]。根據(jù)GLP家族成員之間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系將這類蛋白分為5個亞家族，即真萌發(fā)素亞家族、類萌發(fā)素亞家族1、類萌發(fā)素亞家族2、類萌發(fā)素亞家族3和裸子植物類萌發(fā)素亞家族[3]。在真萌發(fā)素亞家族中，所有成員均具草酸氧化酶（oxalate oxidase，OXO）活性。類萌發(fā)素亞家族1和2及裸子植物萌發(fā)素亞家族成員除具有OXO活性外，部分成員還具有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。目前，人們已在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）[4]以及大豆（Glycine max）[5]中分別鑒定得到32、43、21種類萌發(fā)素蛋白。研究表明，植物類萌發(fā)素蛋白作為酶（OXO[6]、SOD [7]、多酚氧化酶[8]）、結(jié)構(gòu)蛋白[9]和受體（生長素受體[10]和Rhicadhesins受體[11]）的形式參與多種生理生化過程，在植物的生長發(fā)育、生物和非生物脅迫應(yīng)答中起重要的作用。

星星草（Puccinellia tenuiflora）屬于單子葉禾本科堿茅屬，是一種生長在草甸草原、鹽漬化土壤堿斑周圍的冷季型多年生牧草。它具有較強(qiáng)耐鹽堿的能力，可在極端鹽堿性條件下（pH=9～10）完成其生長繁殖周期[12]，被譽(yù)為鹽堿地改良的先鋒植物。

本研究克隆獲得星星草PutGLP2基因，利用生物信息學(xué)手段對該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行分析，以期為深入研究該基因在星星草鹽堿脅迫應(yīng)答過程中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為豐富植物類萌發(fā)素蛋白基因的信息提供資料。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 植物材料

取成熟星星草種子，用NaClO清洗消毒1次，三蒸水沖洗3～5次，25 ℃、光照16 h/黑暗8 h培養(yǎng)2周，整株收取，液氮凍存，用于基因克隆試驗。

1.2? ? 基因克隆

以星星草cDNA為模板，利用PutGLP2基因克隆引物（GLP2-F：ATGGCTCGGTCTTACTCTTCCAC，GLP2-R：TTAG-CCCTTCTTGGGCGCGAAC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段并測序。

1.3? ? 生物信息學(xué)分析

利用Bioedit軟件確定其開放讀碼框;BLASTP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析保守結(jié)構(gòu)域;ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）預(yù)測蛋白質(zhì)分子量、等電點及親水性等;TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析;SignalP 3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽;mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-mul-ti/）、LocTree3（https：//rostlab.org/services/loctree3/）、TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位;通過NCBI和國家水稻數(shù)據(jù)中心（http：//www.ricedata.cn/gene/）搜索水稻GLP（OsGLP）氨基酸序列;利用MEGA7繪制PutGLP2與OsGLP成員間的進(jìn)化樹。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? PutGLP2基因克隆及序列分析

鑒FOX Hunting System，在30 mmol/L NaHCO3條件下，對星星草全長cDNA酵母文庫進(jìn)行抗性篩選，獲得具較強(qiáng)抗性的酵母菌株，克隆其所攜帶基因，得到全長為1 065 bp的PutGLP2。對序列BLSATP分析，發(fā)現(xiàn)PutGLP2具有1個cu-pin結(jié)構(gòu)域，位于該氨基酸序列的64～210位，隸屬于cupin超家族，是一種植物類萌發(fā)素蛋白，見圖1（a）。對序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其5′端非翻譯區(qū)為164 bp，ORF為666 bp，編碼221個氨基酸，3′端非翻譯區(qū)為235 bp，見圖1（b）。

2.2? ? PutGLP2生物信息學(xué)分析

利用ProtParam在線預(yù)測PutGLP2基因編碼蛋白分子量為22.857 kDa，等電點為5.6，酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）20個，堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）17個，屬于酸性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定穩(wěn)定指數(shù)為25.91，推測其為一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)。氨基酸親水性平均值（Grand average of hydropathicity，GR-AVY）為0.223，表明其為疏水性蛋白。

TMHMM分析顯示PutGLP2基因編碼蛋白的N端存在跨膜結(jié)構(gòu)域;SignalP 3.0在線分析顯示其具有1個N端信號肽，在氨基酸第26位的甘氨酸處被剪切。通過TargetP、mP-Loc、LocTree3在線預(yù)測，該蛋白屬于分泌蛋白，定位于胞外或細(xì)胞壁，預(yù)測準(zhǔn)確率為93%。

2.3? ? 星星草PutGLP2與水稻OsGLP聚類分析

星星草與水稻均為單子葉植物，親緣關(guān)系較近。在水稻數(shù)據(jù)庫和NCBI中檢索到了43條OsGLP氨基酸序列。將PutGLP2與OsGLP蛋白進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，PutGLP2是類萌發(fā)素亞家族2的一個成員，并與定位于水稻一號染色體上的OsGLP1-1相似性最高（圖2）。

3? ? 討論

非生物脅迫包括鹽、堿、重金屬和氧化脅迫等。高鹽條件會對植物造成離子毒性、高滲脅迫及次級脅迫（如氧化損傷）[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，類萌發(fā)素基因參與鹽堿脅迫應(yīng)答。大麥中類萌發(fā)素蛋白基因GS1和GS2在成熟的根部和胚芽鞘中表達(dá)，在葉部和根尖分生組織中不表達(dá)，經(jīng)鹽處理后GS1和GS2的表達(dá)量顯著增加，并且在根部的表達(dá)量隨著處理時間的延長逐漸上升，而在胚芽鞘中的表達(dá)量逐漸降低[15]。對檉柳類萌發(fā)素蛋白基因ThGLP在鹽脅迫下的表達(dá)模式分析中，發(fā)現(xiàn)ThGLP基因在檉柳的葉組織中的表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值，為對照的4倍，然后迅速下降，在根組織中表達(dá)量在48 h達(dá)到峰值，為對照的10倍，證明ThGLP參與鹽脅迫應(yīng)答[3]。

目前，人們初步了解類萌發(fā)素在植物生長發(fā)育與生物脅迫應(yīng)答過程中的作用，但其在非生物脅迫，特別是鹽堿脅迫應(yīng)答過程中的機(jī)制尚未解析。本研究成功克隆到星星草類萌發(fā)素基因PutGLP2，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，表明PutGLP2定位于胞外間質(zhì)或細(xì)胞壁中，與水稻中的OsGLP1-1親緣關(guān)系較近。這將為深入研究該基因在星星草鹽堿脅迫應(yīng)答過程中的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)信息。

類萌發(fā)素蛋白在其他植物種子萌發(fā)和脅迫應(yīng)答過程中起到重要作用。而星星草是研究植物耐鹽堿機(jī)制的良好材料，研究類萌發(fā)素蛋白在星星草中如何參與脅迫應(yīng)答，能夠為研究星星草耐鹽堿機(jī)制提供新的思路。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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