SUZ12過表達及敲減惡性外周神經鞘瘤穩定細胞株的建立及其意義

張 靜 ，高 雅 ，李新宇 ，朱香熹 ，孫碩遙 ，肖 可 ，王 靜 ，劉嘉岳 ，趙玉龍 ，李光明 ，朱 澤

（1.天津醫科大學病原生物學系，天津300070；2.天津醫科大學基礎醫學院，天津300070；3.遵義醫科大學珠海校區臨床醫學系，珠海519090；4.多倫多大學圣喬治校區，多倫多ONM5S）

惡性外周神經鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一類具有高度惡性，發展迅速，易轉移復發且預后差的侵襲性軟組織肉瘤，約占所有軟組織肉瘤的5%～10%，其中將近50%的MPNST與NF1基因相關，NF1的病人一生中有10%～15%的風險轉變成MPNST[1-4]。另外，腫瘤抑制因子（TP53和p16INK4A）的喪失和生長因子受體信號（例如EGFR或PDGFR）過度激活在神經纖維瘤的惡性轉化中也起著重要作用。因此，基于這種關聯，MPNST最經典基因學研究大多集中在NF1基因的缺失以及TP53和CDKN2A/p16基因的缺失上[5]。然而最近的一些對MPNST病人的組織標本進行二代測序的研究結果顯示，在MPNST中PRC2的組成單元SUZ12和EDD的突變失活也屬頻發事件[5-9]。PRC2可以調節組蛋白H3的27位點上的酪氨酸三甲基化，而SUZ12作為PRC2復合體的重要組分，可以通過穩定PRC2復合體保證H3K27me3在表觀遺傳修飾過程中功能正常發揮。

CRISPR/Cas9是在細菌和古細菌中發現的一種獲得性免疫系統，通過crRNA識別、Cas蛋白裂解來抵抗病毒和噬菌體的入侵，因其敲除效率高，脫靶率低，敲除效果穩定的優點被用于替代傳統的TALEN技術和ZEN技術，已成為一種主流的基因編輯工具[10-11]。因此，為了進一步研究SUZ12基因在MPNST中的作用，筆者使用慢病毒載體構建SUZ12過表達及CRISPR/Cas9敲減的MPNST穩定細胞株，為針對SUZ12在MPNST中的生物學功能、作用機制和疾病診斷治療的進一步研究提供了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 ST88-14細胞株由天津醫科大學腫瘤醫院楊吉龍教授饋贈；293T細胞和大腸桿菌由本實驗保存；胎牛血清、DMEM培養基購自美國Gibco公司；慢病毒載體系統（GV492、GV371、pHelper1.0、pHelper2.0），Lenti-CAS9-puro 慢病毒購自上海吉凱公司；質粒抽提試劑盒購自Promega公司；TOP10感受態細胞購自Genechem公司；FastQuant RT Kit、SuperRealPreMix Plus購自天根公司；SUZ12引物由北京索真公司合成；MTT試劑盒購自索萊寶公司。

1.2 細胞培養 MPNST細胞系ST88-14在含10%的胎牛血清和1%的雙抗的DMEM完全培養基中培養，37℃，7.5% CO2溫箱中孵育。

1.3 SUZ12基因過表達載體的構建

1.3.1 SUZ12目的基因PCR擴增 SUZ12基因PCR擴增引物，正向引物：5′-AGGTCGACTCTAGA GGATCCCGCCACCATGGCGCCTCAGAAGCACGGC GGTG-3′，反向引物：5′-TCCTTGTAGTCCATACCG AGTTTTTGTTTTTTGCTCTGTTTTG-3′，擴增產物為2 261bp。PCR 體系反應條件：98℃ 5 min，98℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 90 s，循環 30次，72 ℃ 8 min。擴增完成后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳測定結果。

1.3.2 過表達載體的構建 將GV492載體用BamHI/AgeI酶切，PCR產物與載體進行交換，構建重組質粒（設置一組不含SUZ12片段的質粒作為對照組）。重組質粒轉化入感受態細胞，將其涂布在含有氨芐青霉素的平板上，在37℃培養箱中培養過夜，之后進行菌落PCR的鑒定，正義鏈：5′-GATGTTAATGAAGGAGAGAAAG-3′，反義鏈：5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，選取陽性克隆進行轉化，挑菌，質粒抽提，進行測序鑒定。

1.4 SUZ12敲減載體的構建

1.4.1 sgRNA靶位點的設計與合成 在NCBI中明確SUZ12基因的CDS外顯子區域，使用麻省理工學院的CRISPR設計工具（http//crispr.mit.edu/）設計3對SUZ12基因的sgRNA序列，并在其兩端加入BbsⅠ位點，序列見表1。引物退火形成帶有粘性末端的雙鏈，稀釋200倍后使用。

表1 3對特異性sgRNA序列Tab 1 3 pairs of specific sgRNA sequences

1.4.2 sgRNA載體的構建 將GV371載體用BbsⅠ酶切，與退火形成雙鏈的sgRNA混合，配置酶切連接反應體系進行連接，酶切體系：Vector plasmid（100 ng/μL）1 μL，Oligo 雙鏈 DNA（0.089 μmol/L）2 μL，10×Buffer Tango 2 μL，DTT（10 mmol/L）1 μL，ATP (10 mmol/L)1 μL，T7 DNA Ligase 0.5 μL，BbsI 1 μL，H2O 11.5 μL；將上述反應物置于 PCR 儀，37 ℃5 min，21 ℃ 5 min，16 ℃ 30 min，共 6 個循環。將連接產物轉化至TOP10感受態細胞中，接種到含Amp抗性的LB固體培養基上，37℃培養箱中過夜。挑菌，質粒抽提，進行測序鑒定。

1.5 慢病毒包裝與滴度測定

1.5.1 慢病毒包裝 將GV載體質粒、pHelper1.0載體質粒、pHelper 2.0載體質粒按照一定比例（20 μg∶15 μg∶10 μg） 加到 2.4 mL 的 Opti-MEM 和 100 μL的Lipofectamine2000中，共同轉染293T細胞，37℃、5% CO2培養箱中培養。48 h后收集293T細胞上清液，超速離心去除上清，加入病毒保存液，充分溶解后，高速離心，分裝上清，-80℃保存。

1.5.2 慢病毒的滴度檢測 測定前24 h，接種293T細胞到96孔板（4×104個/孔）：在EP管中加入90 μL的無血清培養基，取待測的病毒原液10 μL加入到EP管中，倍比稀釋到最后一管；棄去293T細胞培養基，加入90 μL稀釋好的病毒溶液，37℃培養箱培養；24 h后加入完全培養基，96 h后觀察綠色熒光蛋白的表達情況。

1.6 確定慢病毒感染的最適MOI，以及嘌呤霉素（Puro）篩選的最適劑量

1.6.1 感染預實驗 ST88-14細胞在病毒感染前一天鋪板，至細胞匯合度為20%～30%；病毒于冰上融化，依次將病毒稀釋至滴度 1×108TU/mL，1×107TU/mL，1×106TU/mL，吸棄培養液加入病毒及相應感染增強液，混勻，繼續培養，12 h后換回常規培養基，繼續培養；感染72 h后，用熒光顯微鏡觀察感染效率。

1.6.2 確定嘌呤霉素的最適劑量 將ST88-14細胞接種于48孔板中，48 h后加入Puro進行篩選，Puro 濃度梯度設置為 0、0.5、1、2、4、6 μg/mL；Puro處理48 h后細胞全部死亡的最低藥物濃度作為篩選穩定株的藥物濃度。

1.7 慢病毒感染ST88-14細胞及穩定細胞株的建立1.7.1 過表達穩定株的構建 制備密度為3～5×104個/mL的ST88-14細胞懸液，每孔100 μL接種到96孔板中，37℃培養24 h；病毒冰上融化，根據預實驗MOI值進行稀釋；吸棄培養液加入病毒及相應感染增強液，在37℃、7.5% CO2溫箱中培養，12h后換回常規培養基，繼續培養；感染72 h后，加入2 μg/mL的Puro篩選48 h以上。之后降低Puro濃度到1 μg/mL，繼續對細胞進行篩選和擴增，同時收集細胞行下游RT-qPCR檢測。

1.7.2 CRISPR/Cas9敲除穩定株的構建 制備密度為 3～5×104個/mL 的細胞懸液，每孔 100 μL 接種到96孔板中，37℃培養24 h；Cas9病毒冰上融化，根據預實驗MOI值適當稀釋；吸棄培養液加入病毒及相應感染增強液，在37℃，7.5% CO2溫箱中培養，12 h后換回常規培養基，繼續培養；感染72 h后，加入2 μg/μL的 puromycin篩選至少 48 h以上，得到ST88-14-Cas9細胞。將ST88-14-Cas9細胞鋪6孔板，用含1 μg/mL劑量的Puro的完全培養基培養至30%，按照預實驗感染條件分別感染3個sgRNA的Lenti-sgRNA-GFP病毒，12 h后換回常規培養液，感染48～72 h后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達情況。用含1 μg/mL的Puro的完全培養基擴大培養，繼續傳代、擴增進行鑒定。

1.8 SUZ12過表達和敲減穩定株的鑒定

1.8.1 熒光顯微鏡觀察 用含1 μg/mL Puro篩選兩周后，用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達效率，并拍照。

1.8.2 RT-qPCR鑒定 用TRIzol提取SUZ12過表達組和敲減組總RNA，反轉錄得到cDNA，進行RT-qPCR 檢測，SUZ12 引物序列為：SUZ12-F：AGAAAACGAAATCGTGAGGATGG；SUZ12-R：GCAC GTAGGTCCCTGAGAAA。PCR反應體系為:cDNA template 4 μL，Primer F （20 μmol/L）2 μL，Primer R（20 μmol/L）2 μL，SYBR qPCR Master Mix 10 μL，Rox Dye 0.04 μL，加水至 20 μL；PCR 反應條件：98℃ 2 min，98℃ 10 s，68 ℃ 30 s，循環 40次，95 ℃ 15 s，60℃1 min，99℃15 s。每組實驗獨立重復3次。

1.9 SUZ12過表達和敲減組細胞增殖活性的測定 胰酶消化各組細胞，調整細胞濃度為1×104個/mL，每孔200 μL接種到96孔板；分別在 24、48、72 h后棄上清，加入90 μL完全培養基和10 μL MTT溶液，孵箱內繼續培養4 h；棄上清，每孔加入110 μL DMSO溶液，避光震蕩10 min，490 nm處測吸光度，繪制增長曲線。每組實驗獨立重復3次。

1.10 統計學處理 采用SPSS20.0處理數據，多組間均數比較采用方差分析。P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達重組質粒的鑒定結果 過表達重組質粒SUZ12的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后得到一個2 261bp的特異性條帶，與預期大小一致，見圖1。GV492載體經BamHI/AgeI酶切后與SUZ12基因構建重組質粒，轉化、涂板、挑菌后進行PCR鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳分析，得到469bp的陽性轉化子，見圖2。酶切鑒定陽性的克隆經過測序，結果與NCBI中的人SUZ12基因（ID：23512）進行比對，序列一致，表明過表達重組載體構建成功。

圖1 SUZ12基因擴增電泳圖Fig 1 PCR amplification of SUZ12

圖2 重組載體PCR產物鑒定及瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 2 Identification of recombinant vector and agarose gel electrophoresis

2.2 CRISPR/Cas9表達載體的構建 為了提高敲除效率，設計并合成了3條sgRNA靶向序列，載體GV371（U6-sgRNA-SV40-EGFP）BbsⅠ酶切后，分別與退火獲得的3個目的片段sgRNA連接過夜，轉化TOP10感受態細胞、涂板、挑菌、質粒抽提、送測序鑒定。測序結果表明插入的片段序列與設計合成的靶向SUZ12序列一致，見圖3。

圖3 sgRNA表達載體陽性克隆轉化子測序峰圖Fig 3 sgRNAexpressionvectorpositiveclonetransformantsequencing peak map

2.3 病毒滴度的測定 在倒置熒光顯微鏡下觀察加入不同稀釋倍數病毒原液的293T細胞熒光表達情況顯示，熒光細胞的數目隨病毒稀釋倍數的增加而逐漸減少，估算過表達慢病毒和3種Lenti-sgRNA的病毒滴度分別為 5×108TU/mL、1×109TU/mL、1×109TU/mL 和 1.5×109TU/mL，見圖 4。

圖4 不同稀釋倍數的慢病毒感染293T細胞的熒光表達情況（×200）Fig 4 Fluorescenceexpressionsof293Tcellsinfectedwithlentiviruses at different dilutions(×200)

2.4 慢病毒感染的最適MOI及嘌呤霉素篩選的最適劑量 在不同濃度病毒感染ST88-14細胞72 h后，用顯微鏡觀察熒光表達豐度，感染效率80%左右，細胞生長良好的組所對應的MOI值即可作為后續感染實驗的依據，確定MOI=10為CRISPR/Cas9慢病毒的最佳感染條件，MOI=100為過表達慢病毒的最佳感染條件，見圖5。待ST88-14細胞生長至70%～80%時加入不同濃度的Puro，篩選48 h以上，當Puro的濃度大于等于2 μg/mL時，ST88-14細胞全部死亡，因而確定Puro最適劑量為2 μg/mL，見圖6。

2.5 慢病毒轉染ST88-14細胞的結果 慢病毒轉染ST88-14細胞2周后，用倒置熒光顯微鏡進行觀察，鏡下均可見大量綠色熒光蛋白，并且熒光隨著細胞傳代可持續表達（圖7）。

2.6 穩定株細胞的篩選及鑒定 構建好的SUZ12過表達及敲減慢病毒分別感染ST88-14細胞后，經Puro篩選獲得穩定細胞株，提取RNA進行RT-qPCR檢測。PT-qPCR結果顯示過表達組SUZ12 mRNA表達量明顯較對照組高（P＜0.05），敲減組SUZ12 mRNA表達量相比對照組明顯減少（P＜0.05）。由此說明，SUZ12過表達和敲減的ST88-14穩定細胞株構建成功，見圖8。

圖5 過表達組相同感染條件下不同濃度病毒感染效率比較（×200）Fig 5 Comparison of virus infection efficiency at different concentrations in the same infection conditions(×200)

圖6 不同濃度嘌呤霉素篩選48 h后ST88-14的細胞狀態Fig 6 Cell state of ST88-14 after 48 hours at different concentrations of puromycin

圖7 慢病毒轉染ST88-14細胞后穩定表達綠色熒光蛋白（×200）Fig 7 Stable expression of green fluorescent protein after transfection of ST88-14 cells with lentivirus(×200)

圖8 過表達和敲減組SUZ12 mRNA相對表達情況Fig 8 Relative expression of SUZ12 mRNA in overexpressed and knockdown groups

2.7 SUZ12基因過表達抑制MPNST細胞增殖 SUZ12過表達和敲減穩定株構建完成后，用MTT法測定各組細胞增殖活性的改變。MTT結果顯示，過表達組的細胞增殖活性與陰性對照組相比明顯降低（P＜0.05），敲減組的細胞增殖活性與陰性對照組相比明顯升高（P＜0.05）。表明SUZ12基因過表達抑制MPNST細胞增殖。見圖9。

圖9 過表達和敲除組細胞增殖活性的測定Fig 9 Determination of cell proliferation activity in overexpression and knockout groups

3 討論

SUZ12是多疏抑制復合物2（PRC2）必不可少的組成部分，它可以通過調控組蛋白和DNA甲基化修飾轉錄過程，借此以穩定PRC2，使PRC2的功能正常發揮[12]，除此之外，SUZ12還可以影響組蛋白三甲基化的活性，參與EED-EZH2復合物的功能沉默過程[13]。有研究表明SUZ12在胃癌、結腸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌、套淋巴細胞癌等腫瘤中表達明顯高于癌旁組織，并且，SUZ12表達量的增加提高了腫瘤細胞無限增殖、轉移及侵襲的能力，影響了患者的預后[14-18]。SUZ12在上述腫瘤中表達量增加，促進了腫瘤的發展，然而其在血液系統腫瘤、神經膠質瘤等腫瘤中的表達量明顯低于癌旁組織，這表明SUZ12表達量的減少也促進了腫瘤的發展，同時具有抑癌的作用[19-20]，因而，SUZ12在腫瘤的發生發展過程中發揮了雙向功能。

本研究組在對12例MPNST全基因組進行深度測序后發現，在NF1陰性的散發性MPNST中，SUZ12基因往往呈現缺失狀態[3]，這提示我們SUZ12可能在散發性MPNST的發生發展過程中起到了關鍵作用。Andrew等結合了全外顯子測序隊列的分析、TCGA提供的公開數據，以及對該疾病的前幾代測序研究的回顧，分析計算出了MPNST特異性基因突變率，分別為 NF1（56/64=87.5%），SUZ12（69/123=56.1%），EED（40/123=32.5%），TP53（29/72=40.3%），CDKN2A（54/72=75.0%）[5-9]，也證實在 MPNST 中大多存在SUZ12基因的缺失。研究發現大多數MPNST患者中存在PRC2不同組分功能喪失性突變，而SUZ12和EED的缺失性突變又阻斷了H3K27me3的甲基化進程，導致H3K27me3缺失，引起PRC2染色質調節信號通路失活[21]。研究者在10%～25%的腎癌、肺癌、胃癌和神經膠質瘤中發現了H3K36me3的缺失[22-25]，而H3K36me3的缺失與細胞周期檢查點相關基因存在協同致死效應，WEE1抑制劑AZD1775對H3K36me3缺失的細胞更加敏感[26]，本課題組之前對43例MPNST的組織標本進行免疫組化染色，發現H3K27me3在65.11%的MPNST患者中均缺失[27]，而H3K36me3缺失可以作為用藥靶點也為由PRC2組分突變所致H3K27me3缺失的腫瘤提供了一個表觀遺傳學的治療策略。

本課題組所用的腫瘤細胞系屬于神經細胞，而神經細胞具有不可分裂的特性，使外源片段的導入比較困難，慢病毒載體是由人類免疫缺陷病毒（HIV-1）改造后產生，具有感染效率高、基因片段容量大、持續穩定表達且可感染分裂和非分裂細胞的特點，因此選用慢病毒載體作為基因操作的工具。CRISPR/Cas9是一項新興的基因編輯技術，自問世以來，已廣泛應用于腫瘤領域的科學研究，而且有研究表明，CRISPR/Cas9即使不進行單克隆篩選，也可永久顯著敲低目的基因的表達水平[28]。本實驗通過慢病毒包裝系統制備了SUZ12過表達和CRISPR/Cas9敲減慢病毒，分別轉染ST88-14細胞后，成功獲得了能穩定表達綠色熒光蛋白的SUZ12過表達和敲減穩定細胞株，RT-qPCR的結果也證明過表達組SUZ12 mRNA表達量明顯較對照組高（P＜0.05），敲減組SUZ12 mRNA表達量相比對照組明顯減少（P＜0.05）。MTT結果顯示，過表達組的細胞增殖活性與陰性對照組相比明顯降低（P＜0.05），敲減組的細胞增殖活性與陰性對照組相比明顯升高（P＜0.05）。由此說明，SUZ12基因過表達抑制MPNST細胞增殖。

綜上所述，筆者通過本課題組和其他實驗室的研究數據確定了SUZ12基因在MPNST中處于缺失狀態，而H3K36me3缺失可以作為治療靶點也為PRC2組分缺失突變所致的H3K27me3缺失提供了治療策略，因此筆者構建了SUZ12過表達和敲減的MPNST穩定細胞株，初步探索SUZ12基因表達狀態的變化所引起細胞增殖的改變，本課題組將進一步在體內和體外實驗中探索細胞侵襲遷移、周期等功能的改變，以闡明PRC2功能失活在MPNST的發病演進中的作用及其分子機制，并為MPNST的治療提供了一個基于表觀遺傳學的治療策略。