血管緊張素-（1-7）對快速心房起搏犬心房重構及p38MAPK蛋白表達的影響

張鳳環，上官文鋒，王學文，李廣平

（天津醫科大學第二醫院心臟科，天津心血管病離子與分子機能重點實驗室，天津心臟病學研究所，天津300211）

心房顫動是臨床上最常見的快速性心律失常之一，其病理生理機制主要為心房重構，其中腎素-血管緊張素（RAS）系統發揮重要作用，已證實Ang II有強的促心臟重構作用[1]。而RAS系統中的另一成分，血管緊張素-（1-7）[Ang-（1-7）]可經血管緊張素轉化酶 2/血管緊張素-（1-7）/Mas（ACE2/Ang-（1-7）/Mas）通路對抗Ang II而發揮降血壓、改善心臟重構的作用，并在抗炎癥反應、抗纖維化中也起到作用。p38MAPK信號通路與心肌纖維化、心肌肥大、缺血再灌注損傷有關，但是p38MAPK信號通路是否參與了房顫的病理生理改變，以及Ang-（1-7）對于p38MAPK信號通路有無干預作用尚不明確。本研究擬探討房顫動物模型中心房重構與p38MAPK蛋白激活的關系和Ang-(1-7)的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗設備及材料 健康成年雜種犬購自天津醫科大學動物實驗中心；特制犬高頻心房起搏器購自復旦大學電子工程系；TOP2001多導電生理儀購自上海宏桐有限公司；DF-5A型電生理刺激儀購自蘇州市東方電子儀器廠；Alzet?微量滲透泵購自美國DURECT公司；Masson染色試劑盒購自南京建成科技有限公司；電泳轉膜儀購自Bio-Rad公司；化學發光成像系統購自上海天能公司；Ang-（1-7）試劑購自Bachem公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒購自凱基生物公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體購自全式金公司；小鼠抗大鼠p38MAPK抗體、兔抗大鼠磷酸化p38MAPK抗體購自Abcam公司；HRP標記的羊抗小鼠抗體、HRP標記的羊抗兔抗體購自Promega公司；ECL化學發光液購自Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與模型建立 健康成年雜種犬15只，體質量12Kg左右，雌雄不限，隨機數字表法分為3組：假手術組（Sham，S組），心房起搏組（Pacing，P組）和心房起搏+Ang-（1-7）組（A 組），每組 5只。所有犬均以3%異戊巴比妥鈉30 mg/Kg麻醉，氣管插管連接呼吸機，仰臥位固定，監測心電圖、血氧飽和度、動脈血壓，靜脈點滴5%葡萄糖生理鹽水注射液，分離右側頸外靜脈，穿刺頸外靜脈向近心端送入電極至右心房，電極遠端連接電生理刺激儀，用500次/min快速起搏心房，當記錄到1：1心房奪獲并起搏良好，固定電極，電極末端連接特制犬高頻心房起搏器，起搏電壓5 V，脈寬0.2 ms，頻率500次/min，起搏器埋置于肩胛間區皮下囊袋，術中嚴格無菌操作，術后應用抗生素預防感染，S組起搏器不起搏，P組和A組連續起搏2周，A組同時皮下埋置Alzet?微量滲透泵，經頸外靜脈給予Ang-（1-7）以6 μg/Kg/h持續泵入至實驗結束。

1.2.2 房顫誘發率及持續時間測定 各組犬起搏2周后，3%異戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，連接呼吸機與體表心電圖，正中開胸，暴露心臟，將6對雙極記錄電極分別與高位左心房、低位左心房、左心耳、高位右心房、低位右心房、右心耳連接，將4對電極與左上、下肺靜脈和右上、下肺靜脈連接，各電極與多導電生理記錄儀連接，應用心臟程序期前刺激法測量心房6點基礎起搏周長為250 ms時的心房有效不應期，應用快速刺激誘發房顫，測定各位點的房顫誘發率及持續時間。

1.2.3 心房肌細胞形態學檢查 電生理實驗結束后取出心臟，剪取心房肌組織，冷PBS洗凈血液后于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h，經脫水、石蠟包埋后切片，分別進行HE染色及Masson染色。

1.2.4 Western blot檢測心房肌組織p38MAPK、磷酸化p38MAPK的蛋白表達情況 電生理實驗結束后取出心臟，剪取左心房肌組織，冷PBS洗凈血液，置于凍存管中-80℃保存。剪取適量冷凍組織，液氮法研磨提取蛋白上清液，BCA法測定總蛋白濃度，等量上樣作SDS-PAGE電泳，將凝膠中的蛋白質轉至PVDF膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別于稀釋 β-actin 抗體（1:5 000）、p38MAPK（1:1 000）抗體和磷酸化p38MAPK（1:1 000）抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，于相應二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL法于化學發光呈像系統中曝光，使用Tanon Gis系統進行條帶灰度分析計算凈光密度，以目的蛋白凈光密度/β-actin凈光密度的比值反應目的蛋白相對水平。

1.3 統計學處理 使用SPSS21進行統計學數據分析處理，計量資料用±s表示，多組樣本均數比較使用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組犬起搏前后心室率比較 各組犬起搏前及起搏后心室率比較均無統計學意義，見表1。

表1 各組犬起搏前后心室率比較Tab 1 Comparison of ventricular rate before and after pacing in each group

2.2 各組犬心臟超聲參數變化 快速心房起搏使P組犬左室射血分數較S組明顯降低（P＜0.05），而A組與P組比較左室射血分數提高（P＜0.05）且仍低于S組，但左房內徑、左室舒張末期內徑、室間隔厚度及左室后壁厚度的變化在3組間未達到統計學意義，見表2。

表2 各組犬心臟超聲參數的變化Tab 2 Changes in cardiac ultrasound parameters in each group

LA左房內徑，LVEDD左室舒張末期內徑，LVEF左室射血分數，IVS室間隔厚度，LVPW左室后壁厚度，a與S組比較P＜0.05，b與P組比較P＜0.05

2.3 各組犬心房有效不應期、房顫誘發率及持續時間的變化 與S組相比，P組各部位心房有效不應期明顯縮短，而A組與P組比較在高位右房、高位左房和低位左房的心房有效不應期延長；P組房顫誘發率升高，房顫持續時間延長，A組與P組比較房顫誘發率降低，房顫持續時間縮短，見表3、4。

表3 各組犬房顫誘發率及持續時間Tab 3 AF inducibility and duration in each group

表4 各組犬不同部位心房有效不應期(ms)Tab 4 AERP of each group(ms)

2.4 心房肌細胞結構及形態學變化 HE、Masson染色可以觀察到P組較S組心房肌細胞排列紊亂，細胞大小不均，細胞間纖維組織增多，而Ang-（1-7）干預后可減輕上述變化，見圖1、2。

圖1 心房肌組織HE染色（200×）Fig 1 HE staining of atrial myocardium(200×)

圖2 心房肌組織Masson染色（200×）Fig 2 Masson staining of atrial myocardium(200×)

2.5 p38MAPK、磷酸化p38MAPK蛋白表達情況 與S組相比，P組磷酸化p38MAPK蛋白水平明顯升高（P＜0.05），使用 Ang-（1-7）干預后可使其降低（P＜0.05），但3組p38MAPK蛋白水平的變化未達到統計學意義，見表 5、圖 3。

表5 各組犬左心房各目的蛋白相對表達量平均值Tab 5 Relative expression levels of proteins in the left atrium of each group

圖3 Western blot檢測p38MAPK、磷酸化p38MAPK蛋白表達情況Fig 3 Western blot of p38MAPK and phosphorylated p38MAPK protein expression

3 討論

心房顫動是臨床上常見的一種以心房快速、無序的電活動為特征的心律失常，其對人體的危害主要為血栓栓塞和心功能損害。房顫可使心衰的患病率增加3倍并且加重心衰的癥狀[2]，在本實驗中，兩周的快速心房起搏就可使左室射血分數明顯降低。房顫的病理生理改變主要包括心房的電重構和結構重構，電重構主要表現為心房有效不應期和動作電位時限縮短、動作電位傳導速度減慢、不應期離散度增加等，結構重構則包括心房肌細胞退行性變和心肌間質纖維化等[3]，在我們的前期實驗中已觀察到快速心房起搏可使心房肌細胞離子通道發生改變[4-5]，本實驗中通過快速心房起搏模擬房顫，兩周后關閉心房起搏器，雖然各組犬竇性心律時的心室率變化沒有意義，但是心房起搏組犬心房有效不應期縮短，房顫誘發率及持續時間升高，心肌細胞間纖維組織明顯增多，符合房顫的病理生理改變，即房顫造模成功。

p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員之一，在介導細胞生長、凋亡、炎癥及應激反應等起到十分重要的作用[6]，并與心肌纖維化、心肌肥大、缺血再灌注損傷有關[7-8]。p38MAPK通路也參與了房顫的發生和維持，如在兔肺靜脈肌袖中的研究發現，致房性心律失常作用主要通過激活p38MAPK信號通路[9]；與竇性心律相比，房顫患者心肌局部磷酸化p38MAPK水平明顯升高，據此認為MAPK途徑的激活可能是心房纖維化的分子基礎[10]，p38MAPK還可通過干預炎癥因子及細胞外基質代謝、誘導細胞凋亡、激活成纖維細胞促進膠原沉積等參與心肌纖維化[7]。在細胞水平已證明快速起搏可使心房肌細胞L型鈣通道α1c亞單位、Kv4.3表達下降，磷酸化p38MAPK升高，特異性阻斷p38MAPK可減輕這一變化[11]，即p38MAPK可能參與了電重構，本研究在在體實驗水平也證實快速心房起搏所導致的心房重構伴隨著p38MAPK磷酸化激活，而總p38MAPK水平并無差異，這可能因為外界刺激因素經多級傳遞使磷酸化激酶活化進而磷酸化激活p38MAPK蛋白成為有活性狀態，活化后的p38MAPK蛋白才能調控多種轉錄因子的產生從而發揮作用[6]。目前快速心房起搏與p38MAPK激活的具體調控機制尚不明確，但有研究表明β3腎上腺素能受體在其中起到橋梁的作用[12]。

RAS系統與心血管疾病密切相關，其中的重要效應因子Ang II與AT1R結合可通過多種途徑調控內皮細胞損傷、動脈硬化、心肌纖維化和炎癥反應等[13]。Ang-（1-7）是 RAS 系統的另一活性物質，與Ang II的生理作用相反，其可抑制并改善多種心血管疾病所導致的心肌肥大和纖維化[14]，并在抗炎癥反應中起到作用，如抗白細胞募集、降低促炎因子表達、增加抗炎因子表達等[15]。在筆者的前期實驗中，使用Ang-（1-7）可以減輕快速心房起搏導致的離子通道改變，使電生理指標明顯改善，也可通過降低ACE、ERK1/ERK2的表達，提高ACE2表達減輕心房肌纖維化[5,16-17]。Ang-（1-7）也可干預 p38MAPK 通路，如Ang II可使人臍靜脈血管內皮細胞p38MAPK蛋白磷酸化水平明顯升高，細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）和MCP-1表達明顯升高，而Ang-（1-7）可通過Mas受體，減輕p38MAPK蛋白磷酸化水平從而逆轉這一變化[18]。在本實驗的房顫模型中，Ang-（1-7）可延長心房有效不應期，降低房顫誘發率和持續時間，降低p38MAPK磷酸化激活，改善心肌纖維化，但這些作用是否經Mas受體及是否直接作用于p38MAPK通路還未得知。

在本實驗中，通過快速右心房起搏建立房顫動物模型，可以觀察到心房重構的表現，并且磷酸化p38MAPK蛋白水平顯著升高。磷酸化p38MAPK激活后可能通過介導下游的細胞因子的表達而觸發并加重心房重構，從而導致房顫的發生和持續，而給予Ang-（1-7）干預后，心房重構改善，心房磷酸化p38MAPK蛋白表達水平顯著降低，表明Ang-(1-7)可能通過抑制心房p38MAPK激活發揮其抑制心房重構的作用。但是，心房重構與p38MAPK激活的具體關系及Ang-（1-7）干預p38MAPK通路的具體機制目前尚不明確，需進行深入研究。