間歇性低氧干預提高心梗大鼠心功能和運動耐量

徐凱月，孟祥雪，黃 傳，史 昱，萬春曉

（天津醫科大學總醫院康復醫學科，天津300052）

心血管疾病已成為威脅人類生存的重大疾病之一。盡管心血管疾病的治療技術不斷發展，但心肌梗死及其后的心力衰竭仍是現代社會心血管疾病死亡的主要原因[1]。2013年美國心臟協會數據統計，全美每天有至少2 200人死于心血管疾病。心肌梗死后會引起心肌纖維化，心臟收縮功能下降,心室擴張[2]，導致心臟功能減退，影響生存質量。因此，梗死后的心肌保護，對于心梗后人群提高心臟功能和改善生存質量具有重要意義。

心臟康復作為心血管疾病治療中藥物和手術的有效補充，在改善心臟功能方面得到廣泛認可[3]。近年來，間歇性低氧干預在基礎研究中得到關注，大量實驗證明其能有效保護缺血再灌注大鼠的心肌，改善心臟功能[4]，但對于梗死后存活心肌的影響以及相關分子機制尚不明確。相關研究發現腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）在適應低氧和缺血應激的過程中發揮關鍵作用[5]。一方面，激活的AMPK可以通過抑制腫瘤壞死因子（TNF-α），減少細胞絲素C和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的釋放，從而減少細胞凋亡[6]，降低心肌纖維化，減少心梗面積[7]；另一方面，可以通過增加葡萄糖的攝取[8]，從而促進骨骼肌收縮，提高運動耐量[9]。因此，AMPK能在保護心肌細胞、提高運動耐量等方面發揮重要作用。但間歇性低氧干預與AMPK的相關研究甚少，本實驗擬通過構建大鼠心梗模型進行間歇性低氧干預，觀察AMPK表達及心功能和運動耐量變化關系，旨在探究間歇性低氧干預對梗死后心肌的影響以及分子機制，從而拓展心臟康復方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 28只成年雄性SD大鼠，體質量220～250 g，購于北京華阜通有限公司。飼養地點為天津醫科大學總醫院動物實驗室，室溫為（23±2）℃，相對濕度為50%±10%，晝夜節律為12 h明暗循環。無菌飼料喂養，動物自由獲取食物和水。

1.1.2 主要試劑 MASSON三色染色試劑盒 (北京索萊寶科技有限公司，型號G1340)；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（美國Abcam公司）；HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體（美國Abcam公司）。

1.1.3 主要儀器 小動物人工呼吸機（安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司，型號DW3000）；有機玻璃動物低氧倉（山東煙臺宏遠氧業有限公司，型號DS-3）；動物實驗跑臺（北京眾實迪創科技發展有限公司，型號ZS-PT）；超聲儀（加拿大Visualsonics Inc公司，型號 Vevo770）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 按照隨機數字表法將大鼠隨機分為空白組（Sham，n=6）、空白低氧組（Sham-IH，n=6）、心梗組（MI，n=8）、心梗低氧組（MI-IH，n=8）。

1.2.2 動物模型制備 大鼠腹腔麻醉注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）后取仰臥位，使用小動物呼吸機輔助呼吸，對大鼠進行口腔插管，保持呼吸節律與呼吸機模式一致。備皮，胸骨左緣捫及心臟搏動處縱行切開皮膚約3 cm，逐層鈍性分離，于第四肋間開胸，暴露心臟、血管。在肺動脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標志，以6/0縫線于左心耳根部下方2 mm處進針，進針深度0.5 mm，術中心肌顏色變白，心電圖II導聯顯示ST段升高＞0.1 mV以上，確認為心肌缺血。待心電圖ST段抬高穩定10min后，予以結扎。空白組大鼠以同樣方法暴露心臟，但不進行左冠狀動脈前降支的結扎。

1.2.3 干預方法 術后1周進行干預，將Sham-IH組和MI-IH組放入動物低氧倉內，模擬海拔5000m、氧濃度13%的低氧環境。每天干預4 h，每周5 d，共干預4周。Sham組和MI組放于常氧環境中，干預時間與低氧組相同。

1.2.4 運動耐量 干預4周后，將各組大鼠放于15°傾斜的跑臺上，起始速度為6 m/min，每3 min速度增加3 m/min，至大鼠力竭為止，跑動的總距離作為大鼠的運動耐量[10]。

1.2.5 超聲檢查 分別在術后1周和干預4周后對各組大鼠行心臟超聲檢查，以Sham組大鼠為對照，使用M模塊采集左心室射血分數，數值取測量3個心動周期的平均值。

1.2.6 免疫組織學染色 處死動物，取下心臟，生理鹽水反復沖洗。在心臟結扎點至心尖部位取約厚度3 mm的橫截面，置10%的福爾馬林中固定。包埋制備石蠟切片，切成厚度7 μm石蠟切片，脫水并進行MASSON染色。膠原纖維成分呈藍色，正常心肌呈紅色。采用Image J圖像采集軟件計算心肌梗死面積所占比例（藍色部分面積/藍色+紅色部分的總面積）并進行統計學分析。

1.2.7 Western blot法檢測 提取心肌組織蛋白，冰上裂解并離心，取上清液存于EP管中。BCA法測定蛋白濃度，加裂解液保存于-80℃冰箱備用。配制不同濃度的濃縮膠，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電泳結束后轉至PVDF膜上。TBST清洗，并用牛奶封閉2 h。4℃慢搖過夜孵育一抗，清洗后室溫慢搖1 h孵育二抗。ECL化學發光試劑盒顯色，并用Image J分析軟件進行光密度值計算。

1.3 統計學處理 所有數據采用統計軟件SPSS22.0和GraphPad Prism 6.0軟件處理，并以±s表示。統計方法采用單因素方差分析及組間比較。P＜0.05認為具有統計學顯著差異。

2 結果

2.1 免疫組織學染色比較 如表1所示，與MI組相比，干預4周后MI-IH組的梗死面積比例明顯下降（P＜0.001）（圖 1）。

表1 各組大鼠的心梗面積比例結果比較(±s,%)Tab 1 Comparison of infarct size ratio between groups(±s,%)

表1 各組大鼠的心梗面積比例結果比較(±s,%)Tab 1 Comparison of infarct size ratio between groups(±s,%)

MI-IH組與MI組比較，***P＜0.001

組別 n 心梗面積比例Sham 6 0 Sham-IH 6 0 MI 8 25.78±3.74 MI-IH 8 14.23±0.95***

圖1 干預4周后，大鼠心臟石蠟切片MASSON染色（×40）Fig 1 MASSON staining of paraffin section for rats after four-week intervention（×40）

2.2 心臟超聲檢查結果比較 如圖2所示，干預4周后，MI-IH組的左心室射血分數比干預前（Base）明顯提高（P＜0.001），比4周MI組顯著提高（P＜0.001），4周MI組比干預前也有提高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠心臟超聲檢查結果Fig 2 Results of cardiac ultrasound between groups

2.3 運動耐量比較 如圖3所示，干預4周后，各組的運動耐量均較干預前（Base）有明顯增高（P＜0.001），MI-IH 組比 MI組出現顯著增高（P＜0.001）。

2.4 AMPK蛋白表達的影響 如圖4所示，干預4周后，MI-IH組AMPK表達比MI組明顯增加（P＜0.05），同時比Sham-IH組明顯增加（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠運動耐量比較Fig 3 Comparison of exercise tolerance between groups

圖4 各組大鼠AMPK蛋白的表達情況Fig 4 The expressions of AMPK protein between groups

3 討論

心肌梗死是當今世界主要的致死因素之一。隨著現代科技的發展，藥物和技術的開發應用以及管理模式的改進，心梗患者的死亡率顯著下降[1]。梗死后存活患者如何改善心臟功能，提高運動能力，以及預防再梗死和心血管事件，已經成為心梗后關注的主要內容。歐洲心臟病學學會、美國心臟協會均將心臟康復列為心血管疾病治療中最高級別I級推薦[11]。心臟康復對于提高心臟和運動能力具有重要作用[3]。在心臟康復研究中，間歇性低氧干預作為一種安全、無創、有效的方法，大多作為預處理手段應用于心肌缺血再灌注的研究中，發現可以減少氧化應激損傷和心肌梗死面積[4,12]。但是對于梗死后心肌的影響鮮有研究。

本研究發現，心肌梗死后存活大鼠進行間歇性低氧干預可以顯著減少梗死面積和提高左心室射血分數。心梗面積減少使存活心肌增加，能提高心肌收縮力，改善射血分數[13]。射血分數是預測心肌梗死患者不良心血管事件和死亡率的重要指標[14]。射血分數明顯下降的心梗患者一年內的不良心血管事件發生率與死亡率比左心室功能正常的心梗患者顯著升高[15]。本研究通過心肌梗死面積比例和左室射血分數的變化，揭示了間歇性低氧干預對心肌梗死后大鼠的心臟保護作用。

運動耐量是體現機體活動能力的指標，對衡量心梗患者能否回歸生活和工作具有重要意義[16]，同時也是預測心力衰竭和其他心血管疾病死亡率的重要因素[17]。運動耐量的提高能有效預防心血管病人的心力衰竭[18]，提高患者的生活質量。美國一項長達19年的多中心臨床試驗發現，心肌梗死患者的死亡率的下降與運動耐量提高密切相關，運動耐量每增加1 MET，死亡率隨之降低8%～14%[19]。本研究顯示4周干預后MI-IH組的運動耐量比干預前明顯增加，同時比4周常氧干預的MI組明顯增加，說明間歇性低氧干預有助于提高心梗后大鼠的活動能力，促進其更好地參與日常活動。

AMPK在控制炎癥、調節能量代謝、保護心臟等方面發揮重要作用。相關研究發現，AMPK可以減少心肌細胞的凋亡[20]。Kim等[21]發現缺血再灌注小鼠模型心肌內激活的AMPK，可以減少心梗面積，產生心臟保護作用。本研究顯示間歇性低氧干預4周后MI-IH組的AMPK蛋白表達明顯增加，且研究中也證實了MI-IH組的心肌梗死面積比例減少，左室射血分數提高，提示心梗大鼠在間歇性低氧干預過程中，產生的梗死后心肌保護可能與心肌AMPK的增加有關。

本研究通過4周的間歇性低氧干預，從AMPK蛋白表達、心梗面積比例、射血分數、運動耐量方面證明了間歇性低氧干預對心梗大鼠會產生有效的心臟保護作用，提高活動能力，這可能與心肌AMPK增加有關。由于間歇性低氧干預對心梗康復的作用機制極其復雜，本研究僅探討了AMPK在心梗后心肌保護中的變化，對于AMPK上下游的信號通路變化未有進一步的探索，后續研究中將深入探討，為臨床上心梗患者的心臟康復提供新思路。