ITSN1 mRNA預測乳腺癌預后的價值

張瑩華，馬勇杰

（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤細胞生物學實驗室，國家腫瘤臨床醫學研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060）

乳腺癌是女性發病率最高且異質性很強的惡性腫瘤，嚴重威脅著女性的身心健康[1]。因此探究與乳腺癌預后相關的基因將對其治療有很大意義。Intersectin1（ITSN1）是一種細胞銜接蛋白，主要參與網格蛋白介導的內吞、肌動蛋白細胞骨架重排、細胞信號傳導等生物學過程[2]。除此之外，ITSN1還參與多種疾病的發生發展。研究表明，敲低ITSN1-S可促進肺內皮細胞的增殖[3-4]。ITSN1參與神經母細胞瘤和膠質母細胞瘤的發生發展[5-6]。ITSN1在唐氏綜合征、阿爾茨海默病和亨廷頓病中異常表達[7]。然而，目前關于ITSN1在乳腺癌中的研究較少，僅有兩篇文章報道ITSN1在乳腺癌中的作用，其中也不涉及ITSN1在乳腺癌各亞型中的研究。2015年的一項研究首次報道ITSN1和ITSN2存在于乳腺癌細胞的侵襲性突起中，并且與WIP相互作用，這可能有助于侵襲性偽足的形成，促進細胞侵襲和轉移[8]。2017年，有研究發現CR16和ITSN1在乳腺癌細胞中相互作用，可以增加ITSN1與F-肌動蛋白絲的結合，這可能在肌動蛋白細胞骨架重塑和細胞侵襲中發揮重要作用[9]。以上結果表明，ITSN1在乳腺癌中可能主要通過調控細胞骨架重塑和細胞侵襲/轉移影響細胞存活，對于ITSN1在其中發揮的具體功能還不是很清楚。為此，本研究利用數據庫預測ITSN1對乳腺癌患者預后的影響，期望能夠進一步闡明ITSN1在乳腺癌中可能發揮的功能。

1 材料與方法

1.1 Kaplan-Meier Plotter數據庫 Kaplan-Meier Plotter數據庫（http://kmplot.com/analysis/）包含了乳腺癌樣本基因mRNA表達水平的數據及樣本來源病例的臨床預后相關信息。運用此數據庫，筆者分析了ITSN1 mRNA表達水平與乳腺癌患者預后的關系，所用探針ID為35776-at。對3 955例患者進行無復發生存（recurrence free survival，RFS）分析，1 402 例患者進行總生存（overall survival，OS）分析，這些樣本來源于該數據庫中保存的33個GSE，E-MTAB-365和E-TABM-43。總生存期定義為從疾病確診日期到最后一次隨訪日期或患者死于乳腺癌的日期，無復發生存期定義為從開始用藥到乳腺癌患者最早出現局部復發、遠處轉移或者死亡的時間。病例根據ITSN1 mRNA中位表達水平分成高表達組和低表達組，分別比較兩組乳腺癌患者預后的情況。ITSN1 mRNA的中位表達水平為635，高表達組為2 908，低表達組為108。運用COX回歸分析方法計算兩組病例之間的預后風險比（hazard rations，HRs）和95%置信區間，同時計算log-rank P值，P＜0.05認為有統計學差異。

進行總生存分析的乳腺癌病例（n=1 402）來自以下數據庫：E-MTAB-365（n=537），E-TABM-43（n=37），GSE11121（n=200），GSE12093 （n=136），GSE12276（n=204），GSE1456（n=159），GSE16391（n=55），GSE16446 （n=120），GSE16716 （n=47），GSE17705（n=196），GSE17907（n=54），GSE18728（n=61），GSE19615 （n=115），GSE20194 （n=45），GSE20271（n=96），GSE2034（n=286），GSE20685（n=327），GSE20711 （n=90），GSE21653 （n=240），GSE2603（n=99），GSE26971（n=276），GSE2990（n=102），GSE31448 （n=71），GSE31519 （n=67），GSE32646（n=115），GSE3494（n=251），GSE37946（n=41），GSE41998（n=279），GSE42568（n=121），GSE45255（n=139），GSE4611（n=153），GSE5327（n=58），GSE6532（n=82），GSE7390（n=198），GSE9195（n=77）。

進行無復發生存分析的病例（n=3 955）來以下自數據庫：E-MTAB-365（n=537），E-TABM-43（n=37），GSE11121 （n=200），GSE12093 （n=136），GSE12276（n=204），GSE1456（n=159），GSE16391（n=55），GSE16446 （n=120），GSE16716 （n=47），GSE17705（n=196），GSE17907（n=54），GSE18728（n=61），GSE19615 （n=115），GSE20194 （n=45），GSE20271 （n=96），GSE2034 （n=286），GSE20685（n=327），GSE20711 （n=90），GSE21653 （n=240），GSE2603 （n=99），GSE26971 （n=276），GSE2990（n=102），GSE31448 （n=71），GSE31519 （n=67），GSE32646（n=115），GSE3494（n=251），GSE37946（n=41），GSE41998 （n=279），GSE42568 （n=121），GSE45255 （n=139），GSE4611 （n=153），GSE5327（n=58），GSE6532（n=82），GSE7390（n=198），GSE9195（n=77）。

1.2 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）數據庫 GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)包含的內容很豐富，可尋找差異基因和相似基因，分析腫瘤病人的生存情況，探索兩個基因在腫瘤及正常組織中的表達相關性。利用該數據庫，筆者分析了基因ITSN1和HER2在乳腺癌中的表達情況。該數據庫中保存了TCGA和GTEx兩個數據庫的樣本信息，本研究利用其中的1 085例乳腺癌患者和291例正常對照組進行分析。

2 結果

2.1 ITSN1 mRNA表達水平與乳腺癌患者總人群預后的關系 首先，通過Kaplan-Meier Plotter數據庫分析發現ITSN1 mRNA高表達的乳腺癌患者具有更好的（P=1.3e-07）無復發生存（圖 1B），但不影響患者（P=0.44）的總生存（圖1A）。

圖1 ITSN1 mRNA表達水平與乳腺癌患者總人群OS、RFS的關系Fig 1 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and OS,RFS in breast cancer patients

2.2 ITSN1 mRNA表達水平與不同HER2狀態乳腺癌患者預后的關系 根據不同HER2狀態對乳腺癌患者分類，ITSN1mRNA的表達量主要影響患者的無復發生存。ITSN1mRNA的低表達提示HER2陽性（P=0.007 2）乳腺癌患者更好的無復發生存（圖2C），ITSN1mRNA的高表達提示HER2陰性（P=9e-05）乳腺癌患者更好的無復發生存（圖2D）。但無法預測患者的總生存，HER2陽性（P=0.69），HER2 陰性（P=0.14）（圖2A、2B）。

圖2 ITSN1mRNA表達水平與不同HER2狀態乳腺癌患者預后的關系Fig 2 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and prognosis of breast cancer patients in different HER2 status

2.3 ITSN1 mRNA表達水平與各亞型乳腺癌患者預后的關系 進一步分析看到，ITSN1 mRNA的低表達預示Her-2擴增型乳腺癌（P=0.008 5）更好的總生存（圖 3 C），而在 luminal A（P=0.17），luminal B（P=0.49），基底細胞型（P=0.24）乳腺癌中沒有這種預測價值（圖3 A、3 B、3 D）。

圖3 ITSN1 mRNA表達水平與各亞型乳腺癌患者OS的關系Fig 3 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and OS of breast cancer patients

ITSN1 mRNA的表達水平與乳腺癌患者的無復發生存有一定關系。ITSN1 mRNA的高表達預示luminal A（P=0.000 46），luminal B（P=5.7e-05）乳腺癌患者更好的無復發生存（圖4 A，4 B），而在Her-2擴增（P=0.12），基底細胞型（P=0.64）乳腺癌中沒有這種預測價值（4 C、4 D）。

圖4 ITSN1 mRNA表達水平與各亞型乳腺癌患者RFS的關系Fig 4 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and RFS in breast cancer patients

2.4 ITSN1 mRNA表達水平與不同淋巴結狀態乳腺癌患者預后的關系 根據淋巴結轉移的情況對乳腺癌患者分類，筆者發現ITSN1 mRNA的高表達提示淋巴結陰性（P=0.003 4）乳腺癌更好的總生存（圖5B），淋巴結陽性（P=0.045）乳腺癌更好的無復發生存（圖5 C）。但無法預測淋巴結陽性患者的總生存（P=0.93）（圖5 A）和淋巴結陰性患者的無復發生存（P=0.45）（圖5 D）。

圖5 ITSN1mRNA表達水平與不同淋巴結狀態乳腺癌患者預后的關系Fig 5 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and prognosisof breast cancer patients in different lymph node status

2.5 基因ITSN1和HER2在腫瘤中的表達情況 ITSN1 mRNA的低表達在HER2陽性/擴增型乳腺癌患者中提示更好的預后，而在其他患者中ITSN1 mRNA的高表達提示更好的預后，這說明HER2在ITSN1 mRNA預測乳腺癌預后方面發揮重要作用。為此筆者分別比較了基因ITSN1和HER2在多種癌癥中的表達。兩種基因在數十種癌癥中的表達既有升高也有降低，HER2在乳腺癌中的表達升高，ITSN1在乳腺癌中的表達降低（圖6 A、6 B）。這提示ITSN1在不同腫瘤中可能具有不同的功能，與腫瘤的發生發展密切相關。

在乳腺癌（BRCA）中，通過對1 085例乳腺癌患者和291例正常對照組分析，箱式圖分析結果發現HER2基因的表達高于正常乳腺組織（圖6C），ITSN1基因的表達低于正常乳腺組織（圖6 D），差異均有統計學意義。

圖6 基因HER2和ITSN1在多種腫瘤及對應正常組織中的表達(A,B)，兩種基因在乳腺癌及正常乳腺組織中表達的箱式圖（C,D）Fig 6 Expression of genes HER2 and ITSN1 in various tumors and corresponding normal tissues(A,B),box plots of expression of two genes in breast cancer and normal breast tissues(C,D)

3 討論

ITSN與調控細胞凋亡的線粒體途徑，促進生存的PI3K途徑，調節細胞生長、分化和發育的RTK、Ras、MAPK途徑等密切相關，這些信號通路的改變都將嚴重影響細胞發揮正常的功能，更有可能導致各種疾病的發生。研究表明，過表達ITSN1可以促進成纖維細胞的惡性轉化[10]。

HER2基因在多種癌癥中擴增，包括乳腺癌。HER2是重要的乳腺癌預后判斷因子，據報道，大約15%～25%的患者為HER2陽性乳腺癌[11-12]。cBioPortal數據庫中的Network板塊顯示，HER2基因在乳腺癌中的擴增頻率為22.8%，這與文獻報道一致。

筆者發現ITSN1 mRNA的高表達預示乳腺癌總人群更好的預后，然而，ITSN1 mRNA的低表達卻能夠提示Her-2擴增型乳腺癌患者更長的總生存，HER2陽性乳腺癌患者更長的無復發生存。對于這種現象，筆者提出了以下幾點猜想：HER2可以通過PI3K-AKT通路間接活化NF-kB，阻斷乳腺癌細胞的凋亡，促進細胞生存[13]。另外，PI3K/AKT通路在HER2陽性乳腺癌中過度激活，這可能引起了患者總生存時間短及抗HER2治療耐藥[14]。ITSN1對PI3KAKT途徑具有調節作用，ITSN1與PI3K-C2β發生相互作用形成復合物，促進AKT的磷酸化并激活下游信號通路，促進細胞生存[15]。有研究報道，ITSN1與PI3KC2β在神經母細胞瘤中相互作用，沉默ITSN1可降低細胞生長，過表達PI3K-C2β可逆轉ITSN1沉默導致的細胞生長減慢[16-17]。

HER2與ITSN1存在相互作用并參與藥物反應，這可能對腫瘤患者的生存及化療效果產生重要的影響。總之，HER2與ITSN1都可以調節PI3K/AKT通路，該通路與細胞增殖、生長、遷移和代謝等多個過程密切關聯。至于兩者如何通過調節PI3K/AKT或其他信號通路而影響乳腺癌細胞的存活，具體作用機制有待于深入研究和驗證。

筆者進一步通過GEPIA數據庫分析，發現基因ITSN1和HER2在多種癌癥中異常表達，而在乳腺癌中，HER2基因的表達高于正常組織的2.34倍，ITSN1基因的表達低于正常組織的2.34倍。通過對1 085例乳腺癌患者和291例正常對照組的分析，我們發現ITSN1在乳腺癌中的表達明顯低于正常乳腺組織，HER2在乳腺癌中的表達顯著高于正常乳腺組織。

本研究首次利用Kaplan-Meier Plotter數據庫在線分析了ITSN1 mRNA的表達量對乳腺癌患者預后的影響，我們發現ITSN1 mRNA的高表達能夠提示乳腺癌總人群更長的無復發生存（P=1.3e-07），但不影響患者的總生存（P=0.44）。進一步將乳腺癌患者分類，發現ITSN1 mRNA高表達的luminal A（P=0.000 46），luminal B（P=5.7e-05），HER2 陰性（P=9e-05），淋巴結陽性（P=0.045）乳腺癌患者具有更長的無復發生存時間，高表達ITSN1 mRNA的淋巴結陰性（P=0.0034）乳腺癌患者具有更好的總生存。

總體來說，筆者發現單一考慮ITSN1 mRNA的表達，高表達組患者的預后好于低表達組。如果患者同時被鑒定為HER2陽性/擴增型乳腺癌，那么他的預后實際上差于低表達組。因此，筆者提出綜合考慮ITSN1和HER2評價乳腺癌患者預后的觀點，為精準預測和精準治療提供新的可參考的理論依據。