基于芴母核的新型水溶性弱酸性熒光pH指示劑

李華錕，廖永芳，劉陽平

（天津醫科大學藥學院藥物化學教研室，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070）

細胞內pH的動態變化被認為是理解細胞中許多生理功能調節機制的關鍵[1]。pH值的有效控制對維持細胞正常的生理活動十分重要。目前細胞內pH值測定方法主要有光化學法、弱酸弱堿分布法、微電極法、核磁共振法等幾種。其中光學方法有響應時間快，高信噪比，無創性和良好的pH敏感性等幾個優點。自從首次捕獲到細胞內的pH探測器6-羧基熒光素后，Thomas等[2-3]已經描述了很多pH指標性質[1,4-11]。

為了定量的測量pH值，需要指示劑的pKa與實驗系統的pH值相匹配。溶酶體與內涵體是存在于細胞結構中的亞細胞結構，在細胞的活動中扮演著重要的作用，所以對于這些細胞器的定位與追蹤，具有重要的意義。由于溶酶體和內涵體的pH值分別在4～5和5～6之間，因此開發高效的弱酸性pH熒光指示劑是非常有意義的。在此，筆者報告一種基于新型芴衍生物的敏感的弱酸性熒光pH指示劑。

芴衍生物以其高熒光量子產率和優異的光穩定性著稱[12-13]。最近芴基共軛化合物因為其中具有高雙光子吸收（2PA）橫截面，也被報道為優異的雙光子熒光（2PF）材料[14-18]。因此本文基于芴母核進行衍生化以期得到可以指示弱酸性pH的熒光探針。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 二乙二醇-2-溴乙基甲醚、2,7-二溴芴、正丁基鋰（n-BuLi）、碘化鉀（KI）、二乙胺和2-氨基苯硫酚等試劑購買于阿拉丁試劑公司。干燥的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亞砜（DMSO）購買于Sigma試劑公司。干燥的THF經過金屬鈉干燥處理制備。核磁數據采集于Bruker 400M核磁共振波譜儀上。

1.2 目標化合物的合成路線及合成步驟 見圖1。

1.2.1 化合物9,9-二乙二醇甲醚乙基-2,7-二溴芴2的合成 將2,7-二溴芴（0.907 g,2.8 mmol）、二乙二醇-2-溴乙基甲醚（1.294 g,5.7 mmol）溶于DMSO（7 mL） 中，當然后加入 KI（0.049 g，0.3 mmol）和KOH（0.665 g，11.9 mmol），在氬氣保護下室溫攪拌1 h。將反應液倒入水中（50 mL），乙酸乙酯萃取3次（20 mL×3），有機相水洗，無水 Na2SO4干燥，減壓濃縮。濃縮液經硅膠柱層析純化（PE:EA=10:1）得黃色化合物 2（1.328 g），產率 77%。

圖1 目標化合物5的合成路線Fig 1 The synthetic route of target compound 5

1.2.2 化合物9，9-二乙二醇甲醚乙基-7-溴芴-2-甲醛3的合成 將原料2，7-二溴芴（1.18 g，1.914 mmol）溶于干燥的 THF（7 mL）中，冷卻至-78 ℃，然后緩慢滴加n-BuLi（1.6 mol/L正己烷溶液，1.28 mL）。滴加完畢后 20 min，加入 DMF（0.21 mL，2.693 mmol）與 THF(0.37 mL)的混合溶液，反應液在此溫度下反應1.5 h，然后緩慢升至室溫反應1 h。反應液冷卻至5℃，加入鹽酸水溶液（2 mol/L，1.5 mL）淬滅反應。反應液用乙酸乙酯萃取3次（40 mL×3），合并有機相并用飽和NaHCO3洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸濃縮得粗產品，經硅膠柱層析純化（PE:EA=8:1）得白色目標化合物（0.806 g），產率78.4%。

1.2.3 化合物9，9-二乙二醇甲醚乙基-7-二乙胺基芴-2-甲醛4的合成 將化合物3（0.679 g，1.2 mmol）溶于干燥的DMF（4 mL），然后加入二乙胺（0.877 g，12 mmol），氬氣保護油浴加熱回流反應12 h。反應結束，將反應液倒入水中（50 mL），乙酸乙酯萃取3次（20 mL×3），1N 鹽酸水溶液洗滌（20 mL），水洗（20 mL），無水NaSO4干燥，減壓濃縮。濃縮液經硅膠柱層析純化得化合物4（0.468 g），產率70%。

1.2.4 化合物9，9-二乙二醇甲醚乙基-7-二乙胺基-2-（2-苯并噻唑）芴的合成 將化合物4（0.329，0.59 mmol）和 2-氨基苯硫酚（0.18 g，1.48 mmol）溶于DMSO（3 mL），油浴加熱195℃反應 2.5 h。反應結束將反應液倒入水（30 mL）中，乙酸乙酯萃取3次（20 mL×3），飽和 NaHCO3洗滌，水洗，無水 Na2SO4干燥，減壓濃縮。濃縮液經硅膠柱層析純化（PE:EA=5:1）的黃色目標化合物（0.265 g），產率68%。

2 結果

2.1 目標化合物和中間體核磁數據的表征 在堿性條件下對2,7-二溴芴的9位進行雙烷基取代得到化合物2，然后n-Buli拔溴與DMF反應得到化合物3，隨后再與二乙胺發生親核取代發應得到化合物4，化合物4與2-氨基苯硫酚縮合得到目標化合物5。并對各中間體和目標化合物進行核磁表征，數據如下：

化合物 2：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ7.53-7.45（m，6H），3.54-3.52 （m，4H），3.50-3.47（m，4H），3.40-3.38（m.4H），3.34（s，6H），3.22-3.19（m，4H），2.77（t，J=7.6 Hz，4H），2.33（m，7.6 Hz，4H）（圖 2）。

化合物 3：1H NMR （400 MHz，CDCl3）δ10.05（s,1 H）,7.92（s,1H)，7.88（dd，J=7.6，1.2 Hz，1H），7.79（d，J=8.0 Hz,1H），7.62（d，J=8.4 Hz，1H），7.63（d，J=2.4 Hz，1H），7.51（dd，J=8.0，1.6 Hz，1H），3.51-3.44（m，8H），3.36-3.33（m，10H），3.18-3.16（m，4H），2.79-2.75（m，4H），2.47-2.34（m，4H）（圖 3）。

圖2 化合物2核磁表征Fig 2 MNR Characterization of Compound 2

圖3 化合物3核磁表征Fig 3 MNR Characterization of Compound 3

化合物 4：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ9.96（s，1 H），7.83 （s，1H），7.78 （d，J=7.2 Hz，1H），7.60-7.51（m，2H），7.68-6.57（m，2H），3.51-3.18（m.26H），2.84-2.72（m，4H），2.45-2.26（m，4H），1.21（t，J=7.2 Hz，6H）（圖 4）。

化合物 5：1H NMR （400 MHz，MeOD）δ8.15（s，1H），8.01-7.98（m，3H），7.65-7.39（m，4H），6.80（s，1H），6.75（d，J=6.4 Hz，1H），3.49-3.18（m，26H），2.93-2.80（m，4H），2.51-2.34（m，4H），1.28-1.21（m，6H）（圖 5）。

圖4 化合物4核磁表征Fig 4 MNR Characterization of Compound 4

圖5 化合物5核磁表征Fig 5 MNR Characterization of Compound 5

2.2 化合物5紫外吸收變化與pH值的關系 質子化的化合物5的最大吸收峰在341 nm，中性態化合物5的最大吸收峰在409 nm。紫外吸收光譜隨pH值的變化如圖6所示，隨著pH值的增加，化合物在341 nm的吸收強度逐漸降低，而409 nm的吸收強度逐漸升高，并在355 nm處形成一個等當點。由于與芴相連的二乙胺基氮的堿性明顯高于苯并噻唑氮的堿性，因此質子化優先發生在二乙胺基氮的位置。根據文獻報道的方法，對341 nm處的紫外吸光度進行非線性回歸，結果顯示化合物5的pKa為5.75±0.12。

圖6 在磷酸緩沖液中（50 mmol/L），化合物5（25 μmol/L）的吸收光譜顯示為pH依賴性，箭頭顯示吸收強度隨pH增加而變化。（箭頭）341 nm處吸光系數與pH值非線性擬合Fig 6 pH dependence of the absorption spectra of compound 5(25 μmol/L)inPB buffer(50 mmol/L)with arrow indicating thechange of the absorption intensities with pH increase.(Arrow)Nonlinearfittingof the pH-dependent extinctioncoefficientsat341nm

圖7 在355 nm（吸收等當點波長）處激發，化合物5（10 μmol/L）在磷酸緩沖液(50 mmol/L)中熒光強度顯示pH依賴性，箭頭顯示熒光強度隨pH增加而變化。（箭頭）391nm處熒光強度與pH值的非線性擬合Fig 7 pH-dependence of the fluorescence intensity of compound 5(10 μmol/L)in PB buffer(50 mmol/L)excited at 355 nm(absorption isobestic point wavelength in Fig 1)with arrow indicating the change of the fluorescent intensities with pH increase.(Arrow)Nonlinear fitting of the pH-dependent fluorescent intensity at 391 nm

2.3 目標化合物熒光強度變化與pH值的關系 由圖7所示，當化合物5在等當點（355nm）波長處被激發時，可以觀察到質子態和中性態的熒光發射，分別在392 nm和571 nm。隨著pH值的增加，392 nm處的熒光強度逐漸降低，571 nm處的熒光強度逐漸增加。根據文獻報道的方法，對392 nm處的熒光強度進行非線性回歸，結果顯示化合物5的pKa為5.88±0.06。這一結果與利用341 nm處的紫外吸光度進行非線性回歸所得pKa相吻合。

3 討論

綜上所述，筆者通過4步反應合成了目標化合物5，并對其結構進行了核磁表征。紫外吸光光度法和熒光光譜法顯示，化合物紫外吸光系數與熒光強度隨著pH的變化而變化，通過非線性擬合顯示化合物的pKa為5.88，是一個弱酸性的pH熒光指示劑，筆者下一步的工作將要探索其在弱酸性環境的溶酶體和內涵體方面的應用前景。