微小RNA21對鱗癌細胞生物學影響的研究

王巍　張連齊　楊海燕　夏燕云　李建豪

【摘 要】目的：探討微小RNA-21在口腔鱗癌組織中的表達水平，及其對鱗癌細胞系中的生物學功能的影響。方法：實時熒光PCR定量檢測10例口腔鱗癌標本中微小RNA21的表達情況。口腔鱗癌細胞系轉染微小RNA抑制劑后，檢測其對鱗癌細胞的增殖、侵襲及凋亡的影響。結果：微小RNA21在口腔鱗癌組織中表達明顯上調(diào)，與對照組比較有顯著差異。微小RNA21抑制劑轉染鱗癌細胞系后，細胞的周期發(fā)生了變化，細胞凋亡比率增高，侵襲能力下降。結論：微小RNA21在口腔鱗癌組織中表達上調(diào)，微小RNA21可以抑制口腔鱗癌細胞的凋亡、促進癌細胞增殖，起到了類似原癌基因的作用。

【關鍵詞】口腔鱗癌；微小RNA；增殖；凋亡

【中圖分類號】R36 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2019）01-0011-01

頜面部的惡性腫瘤以口腔鱗狀細胞癌最多見，所占比例在80%以上，其具有侵襲局部周圍組織及區(qū)域淋巴結轉移的特點，晚期還可發(fā)生遠處轉移[1]。目前，在手術中還無法做到腫瘤外科與整形外科完全兼顧，治療后患者多存在明顯的功能障礙和容貌破壞，嚴重威脅人們的身心健康。微小RNA參與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，其中微小RNA21在多種實體瘤細胞中表達升高，并且起到粗癌基因的角色[2]。在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中最重要的機制是細胞中原癌基因激活和抑癌基因失活，最終導致細胞增殖和（或）凋亡調(diào)節(jié)失控[3]。因此，本課題研究微小RNA21在口腔鱗癌細胞系中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 本研究中參與的病人均于術前簽署手術知情同意書。病理標本收集自2017年1月至2017年12月間，就診于哈爾濱醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院。10對口腔鱗癌組織及相應的癌旁正常粘膜組織均采集自口腔鱗癌患者初次手術切除的外科標本。全部病人在手術前均未經(jīng)任何放療和化療。收集到的標本立刻放入凍存管中，標記清楚儲存于-80℃。患者的TNM分期按照2002年美國癌癥聯(lián)盟-國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標準。

1.2 研究方法 提取組織中的RNA，逆轉錄后實時熒光定量PCR檢測細胞中微RNA21的表達情況。培養(yǎng)鱗癌細胞株，收集對數(shù)生長期的細胞支撐細胞懸液，實驗分為3組，即空白對照組，陰性對照組和實驗組。利用酶聯(lián)免疫方法檢測細胞的增值情況，流式細胞分析的方法檢測細胞凋亡情況和細胞周期。

2 結果

2.1 微小RNA21在鱗癌組織中的表達 10例樣本經(jīng)RNA提取后，稀釋10倍，利用Nano測定RNA濃度，滿足純度的樣本進行后續(xù)試驗。實時熒光定量PCR實驗結果顯示，10例口腔鱗癌患者組織中微小RNA21呈現(xiàn)高表達。癌周對照組織相對表達值為1，那么癌組織中平均表達水平為1.9259±0.3615，癌組織的表達顯著高于配對的癌旁組織（t=2.15，P<0.05）。

2.2 細胞增殖的變化 利用細胞活性（R）計算公式將對照細胞統(tǒng)一記作1.0，便于比較不同濃度實驗組的數(shù)據(jù)。三組細胞培養(yǎng)72小時后，測定細胞增殖情況，數(shù)據(jù)見表1.微小RNA21抑制劑組細胞活性受到了抑制，經(jīng)統(tǒng)計學軟件分析后，有顯著意義。

2.3 細胞周期的變化 細胞轉染48小時候，收集細胞，按照細胞周期試劑盒操作，使用流式細胞儀對細胞周期進行檢測，使用細胞周期分析軟件分析結果顯示見表2。轉染組處于G1期的細胞所占比例明顯高于非特異轉染組和空白組，三者之間進行比較，其差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；特異性轉染組處于S期的細胞所占比例也明顯低于非特異轉染組和空白組，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4 細胞凋亡變化檢測結果 使用BD公司細胞凋亡軟件，用Annexinv-FITC和PI標記后24小時內(nèi)上機檢測，結果分析顯示：空白對照組和非特異轉染組的細胞凋亡率分別為8.94%和7.91%，而轉染組的細胞凋亡率是24.24%。空白組合非特異轉染組的凋亡比例相似，均小于特異轉染組，具有統(tǒng)計學意義。

3 討論

迄今為止，外科手術仍然是口腔頜面部良惡性腫瘤的主要治療手段，由于頜面部血管和神經(jīng)豐富，且解剖結構復雜，為手術治療制造了很大障礙[4]。而基因治療自上世紀八十年代開始受到廣泛關注，目前采用RNA干擾技術針對癌基因和抗癌基因進行相關干擾，阻止或促進其表達，從而影響特定細胞比如瘤細胞的生物學活性，改變其細胞活性，進而達到抑制細胞生長，延緩腫瘤發(fā)展的目的[5]。

本課題選擇了10例口腔鱗癌患者的組織標本和鱗癌細胞系作為研究對象，以研究微小RNA21在鱗癌組織中的表達情況。同時，為了去除標本基因表達的個體差異，在腫瘤資質(zhì)周圍采集了正常組織粘膜標本作為對照。研究結果表明：在口腔鱗癌組織細胞中微小RNA21的表達明顯升高，而在正常的腫瘤周圍組織中微小RNA的表達明顯低于實驗組。這同其他的一些在其他實體腫瘤進行的實驗結果相似，這說明微小RNA21和腫瘤的生物學性狀的改變關系密切。本研究結果顯示轉染微小RNA21抑制劑實驗組，當微小RNA21表達受抑制后，鱗癌細胞表達微小RNA21的含量明顯減少，與對照組相比有顯著差異，證實轉染成功。將微小RNA21抑制劑轉染入實驗鱗癌細胞系后，使用流式細胞儀檢測各組細胞增殖、周期和凋亡的情況。結果發(fā)現(xiàn)，微小RNA21受抑制后，細胞的增殖活性受到抑制，凋亡細胞明顯增多。

以上結果均提示微小RNA21在口腔鱗癌細胞中起著癌基因的作用，能夠促進腫瘤細胞的增殖和侵襲。

參考文獻

[1]鄭家偉，李金忠，張志愿. 口腔鱗狀細胞癌臨床流行病學研究現(xiàn)狀[J].中國口腔頜面外科雜志，2007；5（2）：83-90.

[2]俞焙秦，劉炳亞.miRNA的生物學特性和功能[J].上海交通大學學報（醫(yī)學版），2007；5（27）：621-623.

[3]許馳強，肖金剛.轉染miR-214抑制物的口腔鱗癌細胞SCC15增殖、遷移、侵襲能力變化及其機制[J].山東醫(yī)藥2016；56（47）：9-12.

[4]朱曉寒，付紀，陳謙明，曾昕.微小RNA與口腔癌前病變[J].國際口腔醫(yī)學雜志，2012，39（7）：394-397.

[5]陳芬，陳林林.口腔疣狀物、口腔鱗癌與癌基因關系的研究進展[J]實用臨床醫(yī)學，2016， 17（1）：92-94.

基金項目：

黑龍江省教育廳科學技術研究項目（課題編號：12511225）