針刺對腦出血模型大鼠腦組織自噬相關蛋白p62、Beclin-1 表達的影響

劉 昊 杜 嘉 馮培培 阮 晨 張偉波 朱仲華 周 馳 李新偉

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種常見且具有較高的死亡率和發病率的卒中亞型，每年占全球腦卒中的10%～15%[1]。幸存患者多因血腫引起神經元死亡，導致嚴重的神經功能缺損[2]。隨著對ICH 腦損傷機制研究的日益深入，防治腦損傷、提高神經細胞存活率、保護神經細胞功能已成為ICH 機理研究和探索治療方法的重要突破點。ICH后細胞死亡主要有三種類型，包括細胞壞死、凋亡和自噬性細胞死亡[3]。研究表明，血腫周邊組織細胞中存在大量自噬小體結構，證實腦出血可以誘導自噬的激活[4]。自噬的激活很可能是細胞為了清除胞質中受損的細胞器和有害物質而發生的自我保護機制[5]。本研究通過建立自體血ICH 大鼠模型，運用免疫印跡、Western Blot 技術，以自噬相關蛋白p62、Beclin-1 為切入點，探究針刺對ICH 大鼠腦組織自噬表達的影響。

1 實驗材料

1.1 動 物 本研究所有研究流程遵循科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定，符合浙江省立同德醫院實驗動物福利和倫理委員會標準（編號：XMSB20180007）。80只SPF級雄性Sprague-Dawley 大鼠（250～300g）購置于浙江省實驗動物中心，許可證號SCXK（浙）2014-0001。飼養在室溫和濕度人工可控條件下，光照周期12h/12h，給予自由標準飲食飲水。

1.2 主要儀器與試劑 立體定位儀（STW-3X，中國成都儀器廠）；石蠟切片機（CUT5062，德國SELL）；生物組織包埋機（TKY-BMB，湖北泰康醫療設備有限公司）；華佗牌針灸針（0.35mm×40mm，蘇州醫療用品廠有限公司）；生物組織全自動脫水機（TKY-BMB，常州郝思琳醫用儀器有限公司）；電泳儀（B1650001，上海迪申生物技術有限公司）；微量注射器（0406-029K，上海高鴿）；顯微鏡（BX50，日本Oympus）；低溫離心機（002421，美國Thermo）。多聚甲醛（批號AR1068，武漢博士德生物有限公司）；PBS 緩沖液（批號AR0030，武漢博士德生物有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號P0012S，碧云天試劑盒）；PVDF膜（批號IPVH00010，德國Millipore）；兔抗p62 多克隆抗體（批號ab56416，英國Abcam）；兔抗Beclin-1多克隆抗體（批號ab62557，英國Abcam）；兔抗GAPDH 多克隆抗體（批號ab8245，英國Abcam）；羊抗兔IgG（批號ab6721，英國Abcam）。

2 實驗方法

2.1 腦出血模型制備方法 根據大鼠立體定位圖譜[6]（見插頁圖1）制備大鼠腦出血（ICH）模型[7]。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉。將其俯臥位固定于腦立體定向儀上，頭皮中線切口以暴露顱骨和前囟點，在右側前囟點后0.24mm，旁開3.5mm 鉆直徑1mm 的孔洞。50μL 自體血通過微量注射器注入到尾狀核（坐標：AP：-0.24mm，L：3.5mm，D：6mm），以10μL/min 的速度緩慢注入自體血，留針5min 后緩慢退針（見插頁圖1）。切口縫合消毒。假手術組中大鼠僅接受ICH 模型的各項手術過程但不注血。

圖1 大鼠立體定位圖譜確定自體血注入位置

2.2 動物分組 將80 只SPF 級雄性SD 大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、非穴位組、針刺組，每組20 只。假手術組：僅接受ICH 模型制備手術過程，但不注血；模型組：50μL 自體血注入到尾狀核制備ICH 模型，但不進行任何干預；非穴位組：模型組基礎上針刺患側非穴位；針刺組：模型組基礎上針刺患側“百會”透“曲鬢”。

2.3 針刺干預方法 針刺組：大鼠完全蘇醒后，選擇0.35mm×40mm 華佗牌一次性針灸針，根據《實驗針灸學》[8]選取患側“百會”、“曲鬢”穴位（見插頁圖2）。采用“百會”透“曲鬢”針刺法，透刺深度：1.5cm。留針30min，留針期間每5min 以180～200r/min 速度捻轉1 次，共捻轉3 次，每12h 1 次，連續針刺7 天；非穴位組：大鼠完全蘇醒后，取患側非穴位（定位：平行中線距“百會”穴1cm 處，見插頁圖2）采用透刺法，針刺透刺1.5cm，其他操作同針刺組。

圖2 針刺示意圖

2.4 指標檢測

2.4.1 行為學評分 針刺干預7 天后進行行為學[7]評估：前肢放置試驗（也稱觸須誘導前肢放置試驗），輕輕抓起大鼠軀干，緩慢移動使之肌肉放松。通過接觸桌子邊緣來觸碰大鼠觸須，正常大鼠在刺激同側觸須時會將前肢放在桌子邊緣。此過程重復10 次。前肢放置試驗評分=前肢成功放置次數/總次數×100%。拐角試驗，大鼠被置于一個由兩面相連的木板組成的30°拐角中，為了離開拐角，大鼠必須左轉或右轉。評估10 次大鼠轉動情況，每次間隔至少30s。拐角試驗評分=左轉數/全轉數×100%。

2.4.2 大鼠腦組織p62 免疫組化檢測 大鼠行為學評分結束后，腹腔注射倍量戊巴比妥鈉麻醉大鼠，摘取腦出血半暗帶區腦組織，用4%多聚甲醛固定，切成4μm 薄片進行免疫組化染色。切片脫蠟到水，將組織切片置于0.1mol/L 的枸櫞酸溶液（pH=6.0）中修復，水浴20min，用組化筆圈定組織周圍，滴加雙氧水孵育20min，再加入封閉液封閉1h，加入兔抗一抗（p62，1：1000；Beclin-1，1:1500）在37℃孵育2h，再用山羊抗兔IgG 二抗（1：2000），在37℃下孵育30min，洗滌、復染、脫水、透明、封片。在400×顯微鏡下拍攝5 個視野。Image-Pro Plus 6.0 圖像軟件計算平均光密度值（n=10）。

2.4.3 大鼠腦組織Western blot 檢測 用混合的RIPA 裂解緩沖液從腦出血半暗帶區腦組織中提取總蛋白。蛋白濃度用BCA 蛋白檢測試劑盒定量。離心后，用SDS-PAGE 電泳分離，將等量的蛋白質電轉移到0.45μm 的PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入兔抗p62 一抗（1：1500）4℃過夜，再用HRP 標記羊抗兔IgG 二抗（1:2000）在室溫下孵育2h。蛋白信號檢測采用ECL 化學發光試劑，使用ImageJ 軟件測量蛋白質條帶的密度（n=10）。

2.5 統計學方法 數據應用SPSS 18.0 軟件分析，組間比較采用ANOVA 方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t 檢驗，數據以均值±標準差（±s）表示，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組ICH 大鼠行為學評分比較 造模后7 天，與假手術組比較，模型組大鼠出現明顯神經功能缺損體征（P＜0.01）。針刺非穴位未改善ICH 大鼠神經功能缺損體征。與模型組比較，針刺干預能夠明顯提高ICH 大鼠行為學評分（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠行為學評分比較（%，±s）

表1 各組大鼠行為學評分比較（%，±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與非穴位組比較，▲P＜0.01；假手術組：模擬ICH 制備過程但不注血；模型組：自體血誘導ICH 模型；非穴位組：模型組基礎上予針刺非穴位干預；針刺組：模型組基礎上予針刺“百會”透“曲鬢”干預

3.2 各組ICH 大鼠腦組織p62 蛋白表達量比較 免疫組化結果顯示，與假手術組比較，腦出血模型大鼠p62 蛋白表達量明顯增高（P＜0.01）。非穴位組與模型組p62 蛋白表達量相似。與模型組比較，針刺組大鼠腦組織p62 蛋白表達量明顯降低（P＜0.01）。見表2、插頁圖3。

圖3 各組大鼠出血半暗帶區腦組織p62 蛋白表達量比較（免疫酶標染色法，n=10，×400）

表2 各組ICH 大鼠腦組織p62 蛋白表達量比較（±s）

表2 各組ICH 大鼠腦組織p62 蛋白表達量比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與非穴位組比較，▲P＜0.01；假手術組：模擬ICH 制備過程但不注血；模型組：自體血誘導ICH 模型；非穴位組：模型組基礎上予針刺非穴位干預；針刺組：模型組基礎上予針刺“百會”透“曲鬢”干預；ICH：腦出血

3.3 各組ICH 大鼠腦組織p62、Beclin-1 蛋白表達量比較 與假手術組比較，腦出血模型大鼠p62、Beclin-1 蛋白表達量明顯增高（P 均＜0.01）。非穴位組與模型組p62、Beclin-1 蛋白表達量相似。與模型組比較，針刺組ICH 大鼠腦組織p62 表達明顯下調（P＜0.01），Beclin-1 蛋白表達量明顯上調（P 均＜0.01）。見表3、插頁圖4。

圖4 各組ICH 大鼠腦組織p62、Beclin-1 蛋白表達量比較（n=10）

表3 各組ICH 大鼠腦組織p62、Beclin-1 蛋白表達量比較（±s ）

表3 各組ICH 大鼠腦組織p62、Beclin-1 蛋白表達量比較（±s ）

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與非穴位組比較，▲P＜0.01；假手術組：模擬ICH 制備過程但不注血；模型組：自體血誘導ICH 模型；非穴位組：模型組基礎上予針刺非穴位干預；針刺組：模型組基礎上予針刺“百會”透“曲鬢”干預；ICH：腦出血

4 討論

在氧化應激或營養不足的情況下，細胞內的穩態是通過降解受損的細胞或細胞內的成分來維持的[9]。哺乳動物Beclin-1 通過與III 型磷脂酰肌醇3-激酶相互作用，促進磷脂酰肌醇3-磷酸的合成，從而促進脂膜的延伸、貨物的募集和自噬小體的成熟，在自噬的形成中起著重要的作用[10-11]。p62 作為一種胞質蛋白，是鏈接泛素化蛋白與自噬機制的重要調控分子[12]。當自噬被激活時，溶酶體與自噬體結合，將自噬泡中自噬底物p62 以及其他蛋白質和細胞器降解，使得p62 水平降低；反之，p62 水平升高[13]。

腦出血后的腦損傷與炎癥反應、凋亡激活和氧化應激有關，可導致不可逆轉的神經元死亡[14]。近年研究表明，自噬途徑在腦出血后的損傷中也起著重要的作用，自噬的調節可能成為腦出血治療的新靶點[15]。研究發現，ICH 后血腫周圍組織自噬被激活，從6h 開始，12～24h 達到高峰，3 天開始下降，7 天時自噬囊泡在神經元內高度聚集[16]。因此，自噬的激活可能在神經細胞死亡和腦出血的發生發展中起重要作用。

本研究發現，自體血誘導ICH 大鼠能夠引起較嚴重的神經功能缺損體征，并上調腦組織Beclin-1蛋白和p62 蛋白表達，提高自噬的水平。薈萃分析表明，基于百會穴針刺干預急性腦出血大鼠能改善神經功能缺損評分，降低腦水含量[17]。與前期研究相一致，針刺干預可改善大鼠神經功能缺損體征，同時提高ICH 后自噬水平（上調Beclin-1，下調p62）。此研究結果驗證了針刺能夠上調ICH 大鼠自噬水平，并發揮其保護受損神經細胞作用。

綜上所述，腦出血后能夠引起自噬相關蛋白表達的增高，而針刺干預能夠上調腦組織Beclin-1 蛋白，下調p62 蛋白表達，提高自噬水平，進而改善大鼠神經功能缺損體征。