LMNA基因突變與先天性心臟病患者的關系研究

林 煒 王涵磊 林志勇 葛捍偉 薛繼陽 樓志凌 趙琦峰

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)簡稱先心病，是一種由多因素導致的疾病，其致病機制十分復雜，致病因素主要是環境因素和基因因素[1]。先天性心臟病是先天性遺傳病最常見的類型，發生率約為0.6%～1.2%[2]。大約5%～8%的CHD是由于染色體的異常引起的，其中3%的基因缺陷在一級家庭成員中具有高復發風險[3]。我國的先心病發生率呈逐年上升趨勢，每年大約有15萬～20萬的先心病患兒出生[4]。研究CHD的分子機制，不僅對CHD發生的機制和遺傳干預有重要的理論依據作用，而且為探索行之有效的疾病篩查和診治技術預防CHD的發生提供新的思路。

LMNA基因是編碼核纖層蛋白，核纖層蛋白的異常會導致多種疾病的發生，根據臨床特征不同，至今被認識的核纖層蛋白病已有10余種，包括Emery-Dreifuss肌營養不良、Hutchinsong-Gilford早衰綜合征(Hutchinsong-Gilford progeria syndrome，HGPS)、擴張性心肌病等[5]。LMNA基因突變會引起多種心臟異常，如心肌病、心臟傳導異常等，但與先天性心臟發育異常的關系研究未見報道。本研究團隊早期發現1例先天性心臟發育異常[室間隔缺損(VSD)+房間隔缺損(ASD)]伴HGPS的患者(圖1)，早衰綜合征是罕見的兒童過早衰老性疾病，研究發現絕大多數HGPS病例的遺傳基礎是在LMNA基因的第11個外顯子中G608G發生了突變[6]。筆者對該患者進行高通量外顯子測序和群體比對，發現其致病基因也是LMNA基因，并發現了LMNA基因的新突變c.407A>G，蛋白質水平突變為p.D136G(圖2)；筆者對具體突變進行分析，發現突變位點高度保守，同時利用多種軟件預測都提示該突變為致病突變(圖3)。已有報道研究人員利用CRISPR基因編輯技術成功對HGPS突變DNA進行定點編輯及修正[7]。本研究通過分析LMNA基因與先天性心臟病的關系，為未來提早干預并治療先心病提供可能。

圖1 CHD(VSD+ASD)伴HGPS的患兒

圖2 新發現的LMNA基因突變

圖3 LMNA基因新突變保守性分析及預測

編碼核纖層蛋白的LMNA突變可引起一系列表型不同的疾病，本研究擬利用新一代基因測序技術探討LMNA基因突變與人類先天性心臟發育異常的關系，從基因層面探索CHD患者的遺傳學背景，分析LMNA突變在先天性心臟發育異常中的比例與分布情況。

資料與方法

1.一般資料：選取2016～2017年溫州醫科大學附屬第二醫院小兒心胸外科所收治的100例CHD患者并隨機選取100例種族匹配的例行身體檢查的健康兒童作為對照組。CHD組男性62例，女性38例，患兒年齡0.5～14歲，平均年齡2.1±2.7歲。對照組男性60例，女性40例，年齡1～12歲，平均年齡2.4±2.1歲。所有CHD患者均經超聲心動圖、心電圖、胸部X線片及心臟手術確診，排除綜合性先天性心臟病患兒(如Down 綜合征、DiGeorge 綜合征)。本研究經溫州醫科大學倫理學委員會批準，且患兒或家屬均知情同意并簽字。

2.標本采集：患兒均采集空腹外周靜脈血4～5ml至EDTA抗凝采血管中，混勻，將標本存放于-80℃冰箱中，待測。

3.制備基因組DNA：用常規飽和酚-氯仿法提取基因組DNA：①將300～400μl血液加入至1ml細胞裂解液中，充分顛倒混勻后，8000r/min離心10min至細胞沉淀較完全；②棄去上清，取1ml細胞裂解液加入，用槍頭輕輕吹打使細胞沉淀散開，繼續8000r/min離心5min；③重復步驟②直至液體澄清；④棄去上清，分別將STE 300μl、20%SDS 20μl、蛋白酶K(10μg/μl)15μl加入離心管中,充分混勻后置于50℃水浴鍋中12h；⑤12h后從水浴鍋中取出離心管，取100μl飽和NaCl溶液(6mol/L)加入，輕輕晃動可見白色沉淀析出，繼續冰浴10min至沉淀完全析出，4℃環境下5000r/min離心10min；⑥取出上清液至新的離心管中，在通風櫥中取等量體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)加入， 5000r/min離心10min，取上清后加入3倍體積冷乙醇，輕輕顛倒搖晃，有白色絮狀DNA沉淀析出；⑦4℃環境下5000r/min離心10min，棄去冷乙醇，可見離心管底有塊狀DNA沉淀，將離心管倒置于濾紙上使水分自然晾干；⑧加入200μl TE Buffer，并利用紫外分光光度計測定所得DNA濃度，4℃冰箱中保存。

4.引物設計LMNA：LMNA基因序列來自GenBank(NC_000001.11)。利用Primier 5.0軟件設計1～12號外顯子的PCR引物用于擴增目的片段及測序，引物序列見表1。

5.LMNA基因1～12號外顯子PCR反應體系：從離心管中根據所測濃度取出模板DNA約20ng，加入正向與反向引物(10pmol/L)各1μl，2×PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)10μl，補雙蒸水至20μl。其中，PCR 的發生條件如下: 預變性環節，溫度95℃，時間5min; 變性環節，溫度95℃，時間30s; 退火環節，溫度范圍55℃，時間60s; 延伸環節，溫度72℃，時間30s; 終延伸環節，溫度72℃，時間5min。共35個循環。

表1 LMNA基因1～12號外顯子引物序列

6.基因測序： 將PCR產物回收送杭州擎科梓熙生物技術有限公司，以PCR上游引物為測序引物，用ABI 3730xl 自動測序儀進行測序，使用序列分析軟件SnapGene分析測序結果并將所測序列與GenBank 中的已知序列進行比來識別基因變異。

結 果

1.PCR結果：瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物并與標準DNA Marker比對，各PCR產物與設計的各片段大小基本符合。

2.DNA測序結果：在CHD患者組中的LMNA基因中均未發現突變。

討 論

LMNA基因位于1q21.2～q21.3，基因組序列長度56.7kb，其中編碼區域長度約為24kb，共編碼12個外顯子。LMNA基因轉錄時，10號外顯子會發生選擇性剪切，此時會有兩種不同的mRNAs，分別編譯兩種不同的蛋白，即prelamin A和lamin C[8]。prelamin A的C末端是“CAAX”模序，經金屬蛋白酶Zmpste24、肽鏈內切酶2、異戊烯半胱氨酸羧基端甲基轉移酶作用后轉化為lamin A[9]。lamin C和lamin A的N末端有相同的566個氨基酸殘基，由LMNA基因編碼的這兩種主要產物lamin A/C 屬于核膜中間絲蛋白，其作用在于維持細胞核膜內層結構和功能，是核膜中主要的骨架蛋白，它在染色質結構和基因組的空間定位中發揮作用并能決定細胞核的大小和形狀[10,11]。越來越多的證據表明，在DNA復制、RNA轉錄、細胞分化和凋亡中lamin A/C也參與并發揮著重要的作用[12]。有許多研究已經明確了LMNA基因的400多種突變，可表達20多種不同的表現型，與心肌病相關位點就多達100多個，導致各種不同類型的心肌病[13]。LMNA基因突變導致的擴張性心肌病特征為心腔大、室壁薄、常伴有心臟傳導系統疾病、發病早、預后差[14]。筆者前期發現的1例LMNA基因突變國際上尚無報道，此病例患兒表現為早老癥，涉及心血管、骨骼、肌肉及皮膚脂肪等多種系統和組織異常，并無心肌病的表現，但存在CHD(VSD+ASD)，關于LMNA基因與CHD的相關性目前國內外尚無研究報道。

本研究分別通過對100例CHD患兒及100例正常體檢兒童進行LMNA基因的突變篩查，結果未發現任何突變，LMNA基因突變與CHD患者之間可能無明顯相關性。基因在地區、人群、遺傳背景中的分布具有不同的特異性，因此要從多地區、多人群、大樣本的研究中才能明確某一基因在致病過程中發揮的作用，從根本上解釋發病機制。因此，LMNA基因突變是否對CHD具有致病意義尚需要進一步的研究。本研究未發現LMNA基因的致病性突變，筆者認為可能與以下幾個因素有關：①前期發現的LMNA基因突變伴有其他心臟、神經、肌肉、脂肪代謝障礙等病變，而本研究中患者具有這些病變的比例較低；②LMNA基因的突變在先天性心臟病中較為罕見，其突變可能并非是導致先天性心臟病的原因；③研究的樣本數量還不夠大，后續如果有更大的樣本量也許能發現LMNA基因的其他致病性突變。