異質性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌的篩選和生物被膜形成能力的研究

王 兵 楊靖嫻 邵冬華 梁國威

MRSA作為醫院感染的常見病原菌之一，目前治療主要依賴于糖肽類抗生素。隨著萬古霉素臨床使用的增多，臨床上已經出現了耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)、萬古霉素中介金黃色葡萄球菌(VISA)及異質性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌(hVISA)，成為醫學治療的難題。目前認為hVISA作為VISA的前體，母代對萬古霉素敏感，MIC≤2mg/L，但是子代中卻存在少量可以在萬古霉素含量≥4mg/L的BHI平皿上生長的亞群，發生率為10-6～10-5，在治療過程中，隨著不斷存在的萬古霉素的選擇壓力，導致hVISA克隆的增加，并逐漸發展為VISA，對萬古霉素耐藥[1]。目前在臨床上還沒有一種簡單方便并且敏感度和特異性都比較高的方法用于hVISA篩選,這也成為困擾臨床和實驗室工作的難題。本研究以改良菌群分析策略-曲線下面積(PAP-AUC)方法作為金標準，對替考拉寧腦心浸液瓊脂平皿篩選方法進行評價，了解筆者醫院hVISA的發生率，探索出適合筆者醫院檢驗科hVISA的篩選方法和平臺，以便盡早發現并向臨床報道hVISA，引起臨床的重視[2]。同時，筆者也探索了hVISA菌株的生物被膜形成能力以及生物被膜中細菌對抗生素的敏感度，篩選出對其敏感的抗生素，期待對臨床有提示作用，盡早采取措施，避免VISA和VRSA的發生。

材料與方法

1.菌株來源：收集航天中心醫院2014～2017年臨床分離的139株MRSA菌株，其中痰標本59株，血標本37株，鼻拭子19株，分泌物9株，其他15株，所有菌株均經過VITEK2-Compact儀器鑒定,標準菌株ATCC700698(Mu3)購自美國典型菌種保藏中心。

2.試劑和材料：VITEK全自動細菌鑒定儀和比濁儀購自法國生物梅里埃公司，萬古霉素和替考拉寧粉劑購自中國食品藥品檢定研究院，腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar, BHIA)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth, TSB)購自英國OXCID公司，剛果紅干粉購自美國Sigma公司。

3.hVISA篩選：(1)替考拉寧瓊脂平皿篩選法：挑取哥倫比亞血平板上培養過夜的MRSA單個菌落，用0.85%的NaCl溶液配置成0.5麥氏單位的菌懸液，吸取10μl菌液點種在含有替考拉寧5mg/L的BHIA(BHIA5T)上，35℃培養48h，平板上有≥1個菌落為hVISA陽性，每個菌株重復兩次。以ATCC25923為陰性對照，Mu3為陽性對照。(2)改良菌群分析策略-曲線下面積法(PAP-AUC)：制備不同濃度的萬古霉素腦心浸液瓊脂平板：每400ml BHI中分別加入10mg/ml的萬古霉素母液0、20、40、80、100、160、240、320μl，配置成濃度為0、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、6.0、8.0mg/L 8個濃度的BHI平皿。在8ml的TSB中加入培養過夜的純菌落，35℃振蕩培養24h后形成的菌液定義為原液。將原液用0.85%的NaCl溶液稀釋成105CFU/ml和102CFU/ml兩種濃度，然后取原液和稀釋菌液50μl分別均勻涂布到上述7個含萬古霉素的濃度的BHIA上，充分晾干后在35℃溫箱培養48h，以Mu3為陽性對照，ATCC29213為陰性對照。利用Graphpad Prism軟件繪制菌落數lg對數值對萬古霉素濃度的曲線并計算曲線下面積AUC，比較待測菌株的AUC與Mu3的AUC。目前公認的確認標準為(AUC待測菌株/AUCMu3)<0.9為萬古霉素敏感的金黃色葡萄球菌(VSSA)；(AUC待測菌株/AUCMu3)≥1.3為VISA；0.9≤(AUC待測菌株/AUCMu3)<1.3為hVISA。

4.生物被膜形成能力檢測：(1)剛果紅瓊脂實驗：將凍存菌株接種于哥倫比亞血平板上培養過夜，挑取單個菌落接種于剛果紅平板上，37℃培養24h后于室溫放置24h，觀察培養結果。如果出現黑色干燥菌落則提示為生物膜陽性菌株，紅色光滑菌落則提示為生物膜陰性菌株。(2)半定量黏附檢測：采用96孔板培養、結晶紫染色法進行半定量檢測。挑取在哥倫比亞血平板上培養24h的單個菌落，加入8ml的TSB培養液，搖菌過夜；取過夜的菌液用TSB配成0.5麥氏濁度；96孔板中每孔200μl，每個重復3孔，37℃培養24h； 吸取96孔板中的液體，用200μlPBS洗3次，棄去液體； 每孔加入200μl的無水乙醇固定15min，倒掉液體，自然晾干； 每孔加入0.5%的結晶紫200μl，染色2min，PBS洗3次，加入100μl無水乙醇室溫放置10min，595nm處測吸光度值(A值)。按照Christensen等1985年提出的生物被膜黏附程度的分類方法，將生物被膜分為不黏附、弱黏附、中等黏附和強黏附4種，采用微孔板法測定生物被膜的臨界A值(AC),AC等于空白對照的A均值加上其3倍標準差，因此可以根據以下A范圍進行生物被膜分類：A≤AC為不黏附，AC4AC為強黏附[3]。隨后，筆者檢測了低濃度的萬古霉素對生物被膜形成能力的影響，即在配置菌液的時候加入不同濃度的萬古霉素(0、0.5、1.0mg/L)，其他步驟同上。

5.最低抑菌濃度(minimium inhibition concentration, MIC)和最低抑制生物被膜濃度(minimum biofilm inhibitory concentration, MBIC)測定：采用2015年版美國臨床和實驗室標準協會推薦的微量肉湯稀釋法測定MIC。然后，體外制備生物被膜模型，用TSB將萬古霉素做梯度稀釋，濃度范圍為1×MIC～1024×MIC。取200μl加入96孔板生物被膜模型中，無菌TSB作為陰性對照。37℃培養24h，將肉眼觀察無渾濁孔的最低藥物濃度即MBIC。

結 果

1.替考拉寧瓊脂平皿篩選:139株MRSA經過BHIA5T初篩陽性46株。S131、S134和S92菌株在平皿上有菌落生長，為BHIA5T初篩陽性菌株，Mu3為陽性對照，ATCC25923為陰性對照，詳見圖1。

圖1 BHIA5T篩選結果

2.hVISA的臨床分離率：139株MRSA經過PAP-AUC方法檢測，確定hVISA陽性菌株僅1株，為S92,來源于血標本，因此血標本中hVISA的分離率為2.7%，筆者醫院臨床上hVISA的總體分離率為0.72%。這例患者的萬古霉素MIC的濃度為2μg/ml，之前的研究結果也顯示hVISA菌株的萬古霉素的MIC一般集中在1～2μg/ml。PAP-AUC結果如圖2所示。

圖2 菌群分析/曲線下面積(PAP-AUC)圖ATCC700698(Mu3)作為陽性質控菌株，ATCC29213作為陰性質控菌株，AUCS92/AUCMu3=1.21，因此S92為hVISA菌株

3.hVISA的生物被膜形成能力：經過剛果紅瓊脂實驗，S92菌株菌落明顯變黑，顯示有生物被膜形成(圖3)，隨后進行96孔板的培養和結晶紫染色，發現96孔板的底部有明顯的生物膜形成，通過分光光度計檢測，A值(1.00±0.05)明顯高于萬古霉素敏感的29213菌株(0.39±0.05)，空白對照的Ac為0.14，因此，依據A值范圍對生物被膜進行分類，S92屬于強黏附的生物被膜菌株。

圖3 剛果紅瓊脂實驗A.菌落呈現紅色，無生物被膜形成；B.菌落呈現黑色，生物被膜形成陽性

4.低濃度的萬古霉素對生物被膜的影響：在研究中筆者將培養S92菌株的96孔板中加入了1/4MIC即0.5mg/L的萬古霉素，發現此菌株形成生物被膜能力增強了，A值為1.26±0.22，但是萬古霉素濃度增加為1mg/L時，形成的生物被膜減弱了，A值為0.57±0.12(圖4)。

圖4 低濃度萬古霉素對生物被膜的影響

5．生物被膜中細菌對萬古霉素的敏感度降低：通過研究發現S92菌株的最低抑制生物被膜濃度(MBIC)明顯升高，256μg/ml的萬古霉素濃度才能完全抑制生物被膜的生長，生物被膜中的細菌對萬古霉素的敏感度降低，MIC值升高。

討 論

自萬古霉素1958年被美國FDA批準應用于MRSA引起的感染，一直以來對革蘭陽性菌保持著較高的活性，但是自1997年日本首次報道hVISA以來，多個國家也陸續報道發現了hVISA和VISA[4～7]。hVISA存在于VISA前期，雖然hVISA的母代對萬古霉素敏感，但是在萬古霉素的選擇壓力下，hVISA克隆增加，最終形成VISA，對萬古霉素耐藥，并且hVISA存在不同的表型和生物學變化，導致在臨床工作中難以辨認，不能及時發現，因此盡早篩選出hVISA菌株并向臨床報道就至關重要[8]。目前hVISA的檢測方法很多，作為金標準的PAP-AUC方法需要螺旋涂布儀和標準菌株Mu3，耗時費力，無法在臨床常規工作中開展。這幾年推薦的宏量E試驗法，操作簡單，重復性好，也有較高的敏感度和特異性，但是需要萬古霉素和替考拉寧的E-test條，價格昂貴，也難以在臨床工作中推廣。Wang等[9]報道顯示可以用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)進行hVISA檢測，但篩選效果有待進一步的驗證。目前應用較多的篩選方法仍然為含萬古霉素或者替考拉寧的腦心浸液瓊脂平皿篩選法，本研究選用敏感度較高的BHIA5T進行初篩，初篩陽性的菌株再經過PAP-AUC檢測。

不同國家和地區的hVISA分離率差異很大。Chung等[10～13]報道亞洲地區hVISA分離率為3.5%，美國為5.9%，2007年我國14個城市hVISA的檢出率為9.5%，最新報道的山東省檢出率為5.6%。本研究收集了筆者醫院的139例菌株進行檢測，發現了1例來源于血標本的hVISA，分離率為0.72%。相對于其他醫院的報道，目前筆者醫院hVISA的發生率是比較低的，分析原因有兩點：(1)本研究是一個單中心的研究，納入的MRSA菌株相對較少，人群單一。(2)本研究納入的是患者初次入院分離凍存的菌株，沒有經過抗生素的選擇壓力，耐藥性相對較弱。

目前筆者對hVISA的耐藥機制并不是非常了解，比較肯定的是hVISA菌株的細胞壁增厚，增厚的細胞壁交聯會明顯減少，使游離的D-丙氨酰-D-丙氨酰側鏈含量增加，這些游離的側鏈可以與萬古霉素結合，導致萬古霉素被固定在細胞壁中，無法到達作用的靶點。Gregorio等[14]通過自溶實驗分析發現，與萬古霉素敏感的金黃色葡萄球菌比較，hVISA/VISA菌株的自溶活性明顯降低[15]。另外，近期的研究提示hVISA的耐藥可能與生物被膜形成相關，但是對于hVISA菌株的生物被膜形成能力卻存在爭議。Xu等[15]卻報道了hVISA菌株的生物被膜形成能力降低，而Szymanek-Majchrzak等[16]發現對糖肽類抗生素不敏感的MRSA菌株生物被膜形成明顯增強。Kaplan[17]報道了低濃度的抗生素可以促進生物膜的形成。Abdelhady等[18]報道了對萬古霉素治療無效的5株MRSA菌株中有4株在低濃度的萬古霉素存在時，生物被膜形成能力明顯增強。

本研究發現的S92也是一個強黏附的生物被膜菌株，并且在加入低濃度的萬古霉素后，S92的生物被膜形成能力增強，顯示低濃度的萬古霉素對生物被膜有促進作用[17,18]。Chang等[19]研究也證明萬古霉素在體外可以誘導hVISA菌株的耐藥性增強，并且在誘導過程中，發現與生物被膜黏附、聚集和增殖階段相關的多個基因如fnbA、atlA、icaA等的mRNA量增加，細菌的生物被膜形成能力逐漸增加。同時，筆者觀察到hVISA菌株形成生物被膜后，需要明顯提高萬古霉素濃度才能抑制細菌的生長。通過K-B法檢測研究發現hVISA菌株對利奈唑胺和替加環素依然敏感，這與之前的報道也是一致的[20]。這提示在臨床上懷疑有hVISA存在，并且萬古霉素治療時間長，不排除有生物膜形成時，可嘗試換用利奈唑胺和替加環素進行治療。

由于本研究只發現了1株hVISA，無法進行統計分析和分子檢測，后續希望能夠擴大樣本量繼續研究，在分子層面探索hVISA的耐藥機制以及生物被膜形成能力，為臨床治療提供更加可靠的依據。

本研究是首次檢測創建筆者醫院hVISA的檢測平臺，并發現了1株hVISA，它的生物被膜形成能力強，并且低濃度的萬古霉素對生物膜的形成有促進作用，這需要引起臨床的高度重視，合理使用抗生素尤其是糖肽類藥物，也可嘗試換用利奈唑胺或替加環素，以避免VISA和VRSA產生，感染控制不佳，臨床治療失敗。