小紅參對心肌缺血/再灌注損傷NO、氧化應激及線粒體能量代謝的影響*

張光云，童 英，王 礴，陳 普

（云南中醫藥大學云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室，云南 昆明 650500）

心肌缺血/再灌注損傷（Myocardial Ischemia Rreperfusion Injury，MIRI）是嚴重影響心肌缺血后溶栓治療效果的重要病理過程，其發生多認為與大量氧自由基、炎癥反應、Ca2+超載、線粒體功能障礙、血管內皮損傷等有關。其中氧化應激損傷和氧自由基連鎖反應、血管內皮損傷及線粒體能量代謝障礙被認為是導致MIRI二次損傷的關鍵因素[1-2]。大量研究發現，藥物可通過抗氧自由基、增加eNOS活性及其產生的NO含量，改善線粒體能量代謝減輕MIRI，從而發揮保護心肌細胞的作用[3-5]。小紅參為茜草科茜草屬植物滇茜草（Rubia yunnanensis Diels.）的干燥根及根莖[6]，在云南民間用于治療胸痹心痛、心悸、高血壓、脈管炎等已有上百年的歷史。現代藥理學研究發現小紅參具有抗心肌缺血的作用，主要表現為抗血小板聚集，增強小鼠耐缺氧能力和心肌中ATP含量[7]；增加狗急性心肌缺血的冠脈血流量以減輕心肌的損傷[8]；且抗心肌缺血的活性部位主要在乙酸乙酯提取物中[9]。課題組前期研究已表明小紅參乙酸乙酯部位具有縮小心肌梗死面積，降低心電圖S-T段抬高，減少心肌損傷標志物CK-MB和cTnI含量的作用（此部分數據正在他刊投稿中）。因此，基于前期研究和氧化應激及心肌線粒體能量代謝障礙在MIRI發生發展中的關鍵作用，實驗通過復制經典MIRI動物模型，觀察小紅參治療MIRI的作用機制，為小紅參的進一步研究和臨床應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 48只健康Wistar雄性大鼠，SPF級，體質量（280±20）g，購自昆明楚商科技有限公司，許可證號：SCXK（湘）2013-0004，合格證號：0019228。每籠6只飼養，每日光照約12 h，自由飲食、飲水，環境清潔、通風，溫度（22±2）℃，濕度 40%～60%。動物飼養和實驗均符合《醫學實驗動物管理實施細則》要求。實驗符合云南中醫藥大學動物倫理委員會的相關規定。動物購買后適應性喂養1周。

1.2 主要試劑及儀器 小紅參購自云南綠生藥業有限公司（批號：C180634）；復方丹參片（云南白藥集團股份有限公司，批號：A14002034125）；檢測試劑盒（eNOS、NO、ROS）、T-AOC（A015）檢測試劑盒、CAT（A007-1）檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒、細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒、超微量ATP酶Na+-K+和Ca2+測試盒均購自南京建成生物工程研究所；組織線粒體分離試劑盒（ZR0246）購自上海朝瑞技術有限公司。BL-420生物信號采集處理系統（成都泰盟科技有限公司）；V-300多功能小動物呼吸機（上海玉研科學儀器有限公司）；ME104E/02電子天平（梅特勒-拖利多儀器（上海）有限公司）；酶標儀（美國Molecular）；微量移液器（eppendorf公司）；低溫高速冷凍離心機（Thermo公司）；旋渦混勻器（上海啟前）；混合器（江蘇省海門市實驗儀器有限公司）。

1.3 藥物及制備 稱取2 kg小紅參藥材打碎成粉末，以500 g為單位平均分成4份。500 g小紅參分別加入8杯、6杯、4杯（500 mL/杯）95%乙醇浸泡30 min后，加熱回流提取3次，合并提取液，抽濾，濾液用旋轉蒸發儀（t=70℃，r=90）減壓回收乙醇，得濃縮液，同種方法乙醇提取剩余3份小紅參藥材粉末；將濾液用大型分液漏斗分離的乙酸乙酯部分再用旋轉蒸發儀減壓回收，最后得小紅參濃縮液，置于-80℃內冷凍保存，臨用時按低、中、高濃度配制，每次灌胃時將藥物加熱。

1.4 MIRI經典動物模型制備 除假手術組外，其余藥物處理組均在麻醉狀態下對大鼠進行氣管插管和結扎心臟冠狀動脈左前降支30 min，當結扎點以下心肌顏色變白，心電圖ST段進行性抬高弓背向上0.2 mv以上，QRS寬大畸形，標志結扎成功；120 min后再灌注，當心肌顏色逐漸由白變紅，心電圖ST段逐漸回落50%以上，T波逐漸恢復，標志再灌注成功。假手術組大鼠只在結扎點穿線不結扎。

1.5 分組及給藥 ①篩選正常心電圖大鼠，按隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、小紅參低、中、高劑量組、復方丹參片組，共計6組，每組8只。②大鼠給藥劑量按人體表面積的0.018計算。小紅參乙酸乙酯提取物低、中、高劑量組按等效量1∶3∶5計，給藥濃度分別為56.7、170、280 mg/kg；復方丹參片組按生藥量給予300 mg/kg；假手術組和模型組按1 mL/100 g給藥容積灌胃給藥，每天1次，連續14 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 血清中NO、eNOS含量的檢測 各組再灌注2 h后，從腹主動脈取血5 mL置于肝素抗凝管中，靜置30 min后，以3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，保存于-80℃待測。按照試劑盒說明書檢測NO的含量和eNOS的活性。

1.6.2 心肌組織中ROS、ATP、CAT、T-AOC含量的檢測取出心臟，使用預冷的生理鹽水清洗干凈后，在冰上勻漿并配置為10%的心肌組織勻漿液，以3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，保存于-80℃待測。嚴格按照試劑盒說明書檢測心肌組織中ROS、ATP、CAT和T-AOC的含量。

1.6.3 心肌細胞線粒體能量代謝障礙相關指標的檢測取200 mg新鮮的心肌組織，使用生理鹽水清洗后勻漿、研磨；根據線粒體提取試劑盒嚴格操作，從大鼠心臟組織中分離出完整、純化的線粒體；然后采用超微量ATP酶測試盒檢測大鼠心肌細胞中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力，使用線粒體跨膜電位檢測試劑盒（JC-1）檢測大鼠心肌凋亡細胞線粒體膜電位的變化，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 統計學分析 所有數據采用SPSS17.0軟件進行分析，采用均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小紅參對大鼠血清eNOS活性及NO含量的影響與假手術組比較，模型組大鼠血清eNOS的活性及NO的含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，復方丹參片組和小紅參各劑量組均能明顯升高大鼠血清中eNOS的活性及NO的含量（P＜0.05），結果見表1。

2.2 小紅參對氧化應激相關指標的影響 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中ROS的含量明顯升高，CAT和T-AOC的含量明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，復方丹參片組和小紅參各劑量組均能降低大鼠心肌組織中ROS的含量，升高CAT和T-AOC的水平（P＜0.05），其中以復方丹參片組和小紅參中、高劑量組較為顯著，見表2。

表1 小紅參對大鼠血清eNOS活性及NO含量的影響（±s，n=8）

表1 小紅參對大鼠血清eNOS活性及NO含量的影響（±s，n=8）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 給藥劑量/（mg·kg-1）eNOS/（Kat·L-1）NO/（μmol·L-1）假手術組 - 232.04±3.91 58.16±2.33模型組 - 75.79±2.27* 25.36±0.93*復方丹參片組 300 251.81±4.28# 54.39±2.62#小紅參低劑量組 56.7 132.89±2.82# 31.50±2.70#小紅參中劑量組 170 190.96±3.42# 44.05±2.60#小紅參高劑量組 280 240.39±1.77# 52.47±5.20#

表2 小紅參對大鼠心肌組織中相關氧化指標的影響（±s，n=8）

表2 小紅參對大鼠心肌組織中相關氧化指標的影響（±s，n=8）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 給藥劑量/（mg·kg-1）ROS T-AOC/（U·mL-1）假手術組 - 8.63±0.27 76.42±1.69模型組 - 4.38±0.22*復方丹參片組 300 8.19±0.26#小紅參低劑量組 56.7 4.85±0.4#小紅參中劑量組 170 5.47±0.45#143.7±2.62*89.36±2.59#131.33±2.77#122.68±4.08#小紅參高劑量組 280 7.64±0.32#108.12±2.88#CAT/（U·mL-1）51.7±1.3 28.7±1.14*47.57±1.11#31.93±1.2#36.87±2.45#45.1±3.79#

2.3 小紅參對能量代謝ATP及ATP酶的影響 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和 ATP的含量明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，小紅參低劑量組在升高Na+-K+-ATP酶時差異無統計學意義，復方丹參片組和其余的小紅參各劑量組均能升高大鼠心肌組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和 ATP的含量（P＜0.05），見表3。

2.4 小紅參對心肌細胞線粒體膜電位的影響 與假手術組比較，模型組大鼠的心肌細胞線粒體膜電位明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，小紅參低劑量組對大鼠心肌細胞線粒體膜電位升高沒有統計學意義，復方丹參片組和其余的小紅參各劑量組均能明顯升高大鼠心肌細胞線粒體膜電位（P＜0.05），見表4。

表3 小紅參對心肌組織中能量代謝ATP酶及ATP的影響（±s，n=8）

表3 小紅參對心肌組織中能量代謝ATP酶及ATP的影響（±s，n=8）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 給藥劑量/（mg·kg-1）ATP/[mol·（g·prot）-1]假手術組 - 6.46±0.26 Na+-K+-ATP酶/[U·（mg·prot）-1]6.79±0.11模型組 -2.36±0.17*復方丹參片組 300 5.44±0.37#小紅參低劑量組 56.7 2.72±0.24#小紅參中劑量組 170 3.62±0.17#4.55±0.12*6.46±0.09#4.73±0.36 4.91±0.16#小紅參高劑量組 280 4.53±0.29#6.14±0.45#Ca2+-ATP酶/[U·（mg·prot）-1]3.81±0.11 2.71±0.15*3.68±0.2#2.97±0.17#3.08±0.13#3.45±0.17#

表4 小紅參對心肌細胞線粒體膜電位的影響（±s，n=8）

表4 小紅參對心肌細胞線粒體膜電位的影響（±s，n=8）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別給藥劑量/（mg·kg-1）正常細胞/%假手術組 - 32.36±1.4模型組 - 12.42±0.37*復方丹參片組 300 30.37±2.23#小紅參低劑量組 56.7 14.18±2.14小紅參中劑量組 170 25.64±1.87#小紅參高劑量組 280 28.39±1.05#

3 討論

缺血性心臟病為臨床上常見的心血管疾病，已成為引起全球人口死亡的第一位因素，隨著人口老齡化，發病率越來越高，嚴重影響人類健康和生活[10]。MIRI是針對心肌缺血區血液再灌注時出現的一類重要病理損傷。心肌缺血后，及時恢復缺血心肌組織的血流，可有效減輕心肌組織的損傷，但再灌注后產生的大量活性氧自由基（ROS）可引起超氧化物自由基、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基等增多，對細胞膜和蛋白造成直接損害，導致心肌細胞發生功能障礙或壞死[11]。過氧化氫酶（CAT）是天然的抗氧化酶，可催化H2O2產生O2和H2O，對機體的氧化/抗氧化平衡起著至關重要的作用?？偪寡趸芰Γ═-AOC）可反映機體內總體的抗氧化水平，其含量可決定機體的抗氧化能力[12]。實驗結果發現小紅參可降低MIRI大鼠中ROS水平，并提高CAT和T-AOC活性，表明小紅參對MIRI大鼠具有較好的抗氧化能力。

一氧化氮合酶（NOS）是產生一氧化氮（NO）的唯一限速酶，其生物活性可分為內皮型NOS（eNOS）、神經元型NOS（nNOS）和誘導型NOS（iNOS）。其中eNOS主要表達于內皮細胞，其催化生成的NO不僅可調節機體的氧化應激和炎癥水平，還可激活sGC/cGMP通路，起到降血壓和舒張血管的作用[13-14]。研究發現，eNOS基因的高表達可減少心肌缺血/再灌注24 h后的心肌梗死面積，使用eNOS抑制劑干預后，eNOS的心肌保護作用被抑制[15-16]。因此，在MIRI過程中，心肌細胞損害程度與冠狀動脈內皮損傷后導致eNOS的表達下降，NO的釋放減少密切相關[17]。實驗中給予小紅參干預后，MIRI大鼠eNOS活性增強，NO的含量也隨之升高，表明小紅參可通過調節MIRI大鼠體內eNOS和NO水平發揮抗心肌缺血/再灌注損傷的作用。

目前認為MIRI的始動環節可能與能量代謝障礙有關。ATP作為心肌細胞的直接供能物質，在心肌細胞節律性收縮時需要消耗大量的ATP，ATP含量的減少將會導致心肌細胞凋亡或壞死，加劇MIRI[18]。然而，心肌細胞中90%的ATP來源于線粒體，線粒體作為釋放能量的場所，其產生的電子通過呼吸鏈復合體傳遞，進而產生的線粒體膜電位在呼吸鏈復合體和O2的參與下，促使線粒體ATP合成酶生成ATP。線粒體膜電位是維持線粒體結構和功能的根本，目前認為線粒體跨膜電位的下降是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件[19]。研究發現在線粒體內膜上存在許多Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶，它們具有維持細胞膜電位的作用。Na+-K+-ATP酶催化ATP分解釋放能量的同時，可將3個Na+轉出細胞外，又將2個K+轉入細胞內，以維持細胞內外化學梯度及電平衡；Ca2+-ATP酶在催化ATP分解釋放能量時，Ca2+可逆濃度梯度發生主動跨膜轉運，以維持心肌正常的收縮功能。若Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶減少，將會導致鈣超載和氧自由基的增加，進一步影響線粒體代謝功能[19]。實驗結果表明，小紅參干預MIRI模型大鼠后，可提高線粒體能量代謝ATP酶和心肌細胞線粒體的膜電位，表明小紅參可調節MIRI大鼠體內的能量代謝以減輕心肌細胞的損傷。

綜上所述，小紅參對心肌缺血/再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與升高血清中NO水平、抗氧化及改善線粒體能量代謝有關，這為臨床使用小紅參防治MIRI提供了藥理學依據。