基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討杜仲-續(xù)斷藥對(duì)治療腰椎間盤突出癥的作用機(jī)制*

李志超，李丹丹，薛海鵬，徐展望△

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱骨科，山東 濟(jì)南 250355）

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH），是指腰椎間盤發(fā)生退行性改變以后，在外力作用下，纖維環(huán)部分或全部破裂，單獨(dú)或者連同髓核、軟骨終板向外突出，刺激或壓迫竇椎神經(jīng)和神經(jīng)根引起的以腰腿痛為主要癥狀的一種病變[1]。其病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的正常生活。在中醫(yī)學(xué)中，將腰椎間盤突出癥歸于“腰痛”“腰腿痛”“痹癥”等范疇，病因病機(jī)多為跌仆閃挫，氣血瘀滯，或腎精虛損，筋骨失養(yǎng)，或寒濕內(nèi)浸，阻遏經(jīng)脈等[2]。

臨床上杜仲和續(xù)斷配伍常用于LDH的治療，其中杜仲能夠補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨；續(xù)斷能夠補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷。現(xiàn)代研究表明杜仲中的有效成分具有保肝護(hù)腎、提高骨密度、抑制骨吸收、調(diào)節(jié)骨代謝、延緩衰老、抗疲勞等作用[3-4]。續(xù)斷中的有效成分具有保護(hù)骨組織、保肝降脂、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[5]。由此可見(jiàn)，杜仲-續(xù)斷配伍治療LDH的療效確切。然而由于中藥多成分、多靶點(diǎn)、相互協(xié)同作用的特點(diǎn)，使得中藥治療疾病的作用機(jī)制十分復(fù)雜。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用多層次網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，從整體角度分析藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，這種整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中藥治療的整體觀念和辨證論治的原則不謀而合。本研究選擇常用藥杜仲-續(xù)斷藥對(duì)開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，以期明確杜仲、續(xù)斷有效成分及作用靶點(diǎn)，并進(jìn)一步分析該藥對(duì)治療LDH的作用機(jī)制，為L(zhǎng)DH治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 杜仲、續(xù)斷藥對(duì)活性成分的獲取與篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional ChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabase and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php）中分別錄入杜仲、續(xù)斷進(jìn)行檢索，按口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性DL≥0.18條件篩選出有效成分。

1.2 杜仲、續(xù)斷藥對(duì)靶點(diǎn)的整理 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出杜仲-續(xù)斷藥對(duì)有效成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，然后導(dǎo)入 Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.unitprot.org/），進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 LDH靶點(diǎn)的獲取與預(yù)測(cè) 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)以及 OMIM（http：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“l(fā)umbar disc herniation”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將檢索到的蛋白名稱復(fù)制到Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到疾病相關(guān)的靶點(diǎn)信息。

1.4 杜仲-續(xù)斷活性成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將杜仲、續(xù)斷的活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建有效成分的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥Ｔ诰W(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表化合物信息，邊代表有效成分－靶點(diǎn)的相互作用。

1.5 蛋白（PPI）互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 先將杜仲、續(xù)斷的有效成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行去重，再與LDH靶點(diǎn)組建“成分-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫(kù)，取兩者交集，組成“成分-靶點(diǎn)”映射文件，即尋找成分與疾病共有的靶點(diǎn)，將共有靶點(diǎn)與化合物成分輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建“杜仲、續(xù)斷-LDH靶點(diǎn)”的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape3.7.2軟件中的Network Analyzer進(jìn)行分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度（degree≥9）值進(jìn)行篩選，得到杜仲-續(xù)斷治療LDH的核心作用靶點(diǎn)。

1.6 生物通路及富集分析 將1.5篩選出的PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶標(biāo)導(dǎo)入 DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析以及 GO（Gene Ontology）生物過(guò)程的富集分析。以P≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出符合條件的前20條GO生物過(guò)程與23條KEGG通路，并用表格的形式展示。通過(guò)通路富集結(jié)果對(duì)杜仲-續(xù)斷治療LDH的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲-續(xù)斷藥對(duì)有效成分的靶點(diǎn)篩選及預(yù)測(cè)利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，分別將杜仲、續(xù)斷輸入到數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行成分搜索，將得到的成分按照口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選，得到有效成分共36個(gè)，其中杜仲有效成分28個(gè)，續(xù)斷有效成分8個(gè)（見(jiàn)表1）。

2.2 杜仲-續(xù)斷成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 利用TCMSP網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，將杜仲-續(xù)斷藥對(duì)的36個(gè)有效成分進(jìn)行檢索，獲取其有效成分相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，共1 785個(gè)。并將其導(dǎo)入U(xiǎn)nitprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因名標(biāo)準(zhǔn)化處理，再通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“杜仲-續(xù)斷有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。

表1 杜仲-續(xù)斷有效成分

圖1 杜仲-續(xù)斷有效成分靶點(diǎn)-網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)圖中共有168節(jié)點(diǎn)組成，“V字形”代表中藥杜仲和續(xù)斷，“藍(lán)色橢圓形”代表杜仲-續(xù)斷中有效成分共36節(jié)點(diǎn)，“紅色橢圓形”代表有效成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共132節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的邊表示藥物成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，最大自由度104，最小自由度為1，平均自由度為8.84，其中度值排名前五的為β-谷甾醇、槲皮素、Cinchonan-9-al，6＇-methoxy-，（9R）-、山柰酚、（-）-Tabernemontanine，節(jié)點(diǎn)的自由度值分別為 104、88、56、56、52，說(shuō)明這些化合物是杜仲-續(xù)斷治療腰椎間盤突出癥的主要活性成分。

2.3 LDH相關(guān)靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的與LDH相關(guān)的靶點(diǎn)有366個(gè)。將這些基因?qū)ytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖2）。圖中共有366節(jié)點(diǎn)組成，紅色圓形為疾病“腰椎間盤突出癥”，藍(lán)色矩形為疾病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的邊表示疾病LDH與靶點(diǎn)蛋白之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖2 LDH-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 杜仲-續(xù)斷“成分-疾病”靶點(diǎn)PPI圖

2.4 核心靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)網(wǎng)絡(luò)合并，獲得杜仲-續(xù)斷和LDH的共有靶點(diǎn)36個(gè)（見(jiàn)表2）。將這36個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)建立杜仲-續(xù)斷“成分-疾病”靶點(diǎn)蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），共得到36個(gè)節(jié)點(diǎn)，382條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為21.2；再將該結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，再通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯詃egree值≥22為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到20個(gè)核心靶點(diǎn)，環(huán)加氧酶（PTGS2）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）、白介素-1B（IL-1B）、C-C 基序趨化因子（2CCL2）、促分裂原活化蛋白激酶 8（MAPK8）、雌激素受體（ESR1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A（VEGFA）、促分裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素 γ（IFNG）、基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP2）、一氧化氮合酶（NOS3）、轉(zhuǎn)錄因子（JUN）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子R（EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤抑制基因 p53（TP53），一起構(gòu)成核心網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。

表2 杜仲-續(xù)斷-LDH共有靶點(diǎn)

圖4“成分-疾病”核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表3 杜仲-續(xù)斷調(diào)控治療LDH生物過(guò)程分析

2.5 GO生物過(guò)程結(jié)果分析 將2.4項(xiàng)得到的核心靶點(diǎn)錄入David數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行GO生物過(guò)程分析，得到分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞成分條目315個(gè)，以P≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出符合條件的前20個(gè)GO條目（見(jiàn)表3）。主要包括一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、細(xì)胞外間隙（extracellular space）、基因表達(dá)的正調(diào)控（positive regulation of gene expres－sion）、細(xì)胞外區(qū)（extracellular region）、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路（lipopolysaccharide-mediated signaling pathway）、血管生成（angiogenesis）、缺氧反應(yīng)（response to hypoxia）等生物過(guò)程。

2.6 KEGG通路富集分析 將2.4項(xiàng)得到的核心靶點(diǎn)錄入David數(shù)據(jù)庫(kù)，得到KEGG通路80條，以P≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出符合條件的23條信號(hào)通路（見(jiàn)表4），其中包括美洲錐蟲病（Chagas disease）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis）、膀胱癌（Bladder cancer）、利什曼病（Leishmaniasis）等信號(hào)通路，其中，與LDH相關(guān)的通路可能為HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路。

3 討論

表4 KEGG富集分析表

中醫(yī)學(xué)中LDH多屬于“腰痛”“腰腿痛”“痹癥”等范疇。《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》將LDH規(guī)范為血瘀證、寒濕證、濕熱證和肝腎虧虛證四證。歷代醫(yī)家對(duì)腰痛病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)各有不同，對(duì)本病的辨證論治有不同的側(cè)重，其中以補(bǔ)益肝腎為基本治法的方藥使用較多。杜仲、續(xù)斷二者味甘性溫，歸肝、腎經(jīng)，皆能補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，是臨床治療肝腎虧虛之腰椎間盤突出癥的常用藥對(duì)[6]。《玉楸藥解》中記載：“杜仲，益肝腎，養(yǎng)筋骨，祛關(guān)節(jié)濕淫，治腰膝酸痛，腿足拘攣”；侯士良《中藥八百種詳解》中記載：“杜仲，甘溫補(bǔ)肝腎，壯筋骨，為治腰痛必用之品”。《滇南本草》中記載：“續(xù)斷，補(bǔ)肝，強(qiáng)筋骨。走經(jīng)絡(luò)，止經(jīng)中疼痛”，《日華子本草》中記載：“續(xù)斷，助氣，調(diào)血脈，補(bǔ)五勞七傷。”杜仲-續(xù)斷藥對(duì)在歷代醫(yī)家的驗(yàn)方使用中十分常見(jiàn)，《千金要方》丹參丸，《扶壽精方》續(xù)斷丸，《本事方》思仙續(xù)斷丸等，均重視杜仲、續(xù)斷兩藥配伍，效果顯著。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[7]，杜仲-續(xù)斷配伍在補(bǔ)腎強(qiáng)骨中存在整體調(diào)節(jié)和綜合治療的優(yōu)勢(shì)，具有良好的臨床療效。

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)分析得出，β-谷甾醇、槲皮素和山柰酚可能是杜仲-續(xù)斷藥對(duì)治療LDH的關(guān)鍵成分。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)人體甾體激素等多種生理作用[8]。β-谷甾醇可以通過(guò)減少NO的合成，抑制巨噬細(xì)胞IL-6活性，減少IL-1、TNF等炎性因子的分泌，起到抗炎的作用[9]。有研究證實(shí)，β-谷甾醇可顯著降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物含量、提高谷胱甘肽水平，減輕脂質(zhì)蓄積造成的肝細(xì)胞的過(guò)氧化損傷，從而起到保護(hù)肝臟的作用[10]。槲皮素具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫抑制等廣泛的藥理作用[11]。胡慶華等[12]研究表明，槲皮素可明顯緩解高果糖飲食或氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)的高尿酸血癥，并可通過(guò)下調(diào)NLRP3炎癥體各組分和TLRs信號(hào)通路中關(guān)鍵分子基因和蛋白水平，緩解腎臟炎癥反應(yīng)及減輕腎損傷，起到改善腎功能的作用。袁小亮等[13]研究表明，槲皮素可顯著降低MMP-13/TIMP-1的比例，促進(jìn)抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)。山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用[14]。研究表明山柰酚可顯著降低IL-1B等因子的表達(dá)，抑制大鼠OA軟骨細(xì)胞促炎介質(zhì)的表達(dá)[15]。湯利華等[16]的實(shí)驗(yàn)研究表明，在糖尿病腎病大鼠中，山奈酚能夠降低大鼠蛋白尿、血肌酐和尿素氮含量，同時(shí)降低Caspase-3、Caspase-9、NLRP3、ASC和Caspase-1及炎癥因子IL-18和IL-1B的表達(dá)水平，對(duì)腎功能和組織病理?yè)p傷具有保護(hù)作用。故杜仲-續(xù)斷藥對(duì)中的β-谷甾醇、槲皮素和山柰酚等有效成分，表現(xiàn)出抗炎、保護(hù)肝臟、改善腎功能、保護(hù)軟骨等顯著功效，很可能是治療LDH的有效成分。

杜仲-續(xù)斷治療LDH的多個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)對(duì)“藥物-疾病”核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析，結(jié)果顯示 PTGS2、MMP3、TNF、IL-6、IL-1B 等 20 個(gè)核心靶點(diǎn)在杜仲-續(xù)斷治療LDH中發(fā)揮了重要作用。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一致認(rèn)為椎間盤退變是LDH最本質(zhì)的病理變化之一，不僅表現(xiàn)有形態(tài)學(xué)和組織學(xué)的變化，同時(shí)也伴隨生化性質(zhì)的一系列改變。其中，IL-6、IL-1B、TNF和MMP3都是重要的細(xì)胞因子，是可能導(dǎo)致椎間盤退變的原因之一[17]。MMP3是細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要蛋白之一，能夠改變椎間盤基質(zhì)內(nèi)蛋白多糖、膠原、彈性蛋白等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及含量，從而在椎間盤退變和突出中起作用[18-19]。IL-6可刺激炎癥細(xì)胞聚集、促進(jìn)炎癥介質(zhì)合成，誘導(dǎo)MMPS的表達(dá)，破壞蛋白聚糖II型膠原的比例，使髓核脫水，加速椎間盤退變[20]。TNF內(nèi)的多種生物學(xué)活性可以促進(jìn)細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的生成，改變內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，參與痛覺(jué)敏感性的形成；誘導(dǎo)MMPS活性上調(diào)，減少膠原和蛋白多糖的合成[21-22]。在一項(xiàng)骨關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素能減少IL-1B、TNF、IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[23]。PTGS2可參與炎癥、凋亡和免疫反應(yīng)，細(xì)胞因子和趨化因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的生成和分化[24-25]。由此可見(jiàn)，杜仲-續(xù)斷可能通過(guò)作用于以上 IL-6、IL-1B、MMP3、TNF 和 PTGS2 等靶點(diǎn)，參與治療LDH的消炎鎮(zhèn)痛、抑制椎間盤的退變等過(guò)程。

通過(guò)KEGG通路富集分析，HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等可能是治療LDH的關(guān)鍵通路。張丹等[26]認(rèn)為，HIF-1在成血管-成骨耦連反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，作為上游基因調(diào)控著體內(nèi)多種成血管、成骨基因的表達(dá)，促進(jìn)血管形成的同時(shí)，協(xié)同促進(jìn)骨的再生。TNF信號(hào)通路中的TNF-α不僅可以使其信號(hào)通路發(fā)生異常，還可以和其他促炎性細(xì)胞因子刺激破骨細(xì)胞分化和活化，而引起骨丟失，刺激滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生降解軟骨的蛋白酶，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨的破壞[27]。故杜仲－續(xù)斷中的β-谷甾醇、槲皮素和山奈酚等很可能通過(guò) IL-6、IL-1B、TNF、MMP3、PTGS2等靶點(diǎn)作用于HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路，參與各細(xì)胞因子的調(diào)控，抑制炎性因子表達(dá)，促進(jìn)骨的生成，減少軟骨和關(guān)節(jié)的破壞，從而發(fā)揮治療LDH的作用。

綜上所述，杜仲-續(xù)斷在治療LDH上具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，因數(shù)據(jù)有限，存在一定的局限性，從整體層面分析藥物與疾病間的作用機(jī)制，初步預(yù)測(cè)了杜仲-續(xù)斷藥對(duì)參與治療LDH的核心靶標(biāo)，為治療LDH提供了一些新的思路，也為今后進(jìn)一步的分子生物學(xué)驗(yàn)證提供了理論基礎(chǔ)。