柚皮苷和柚皮素對枸櫞酸噴托維林經(jīng)大鼠肝微粒體代謝的影響

謝鏜寧，吳灝，王永剛，彭維，蘇薇薇，李沛波

(中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

柚皮苷屬于二氫黃酮類化合物，化學名為7-[[2-O-(6-脫氧-α-L-鼠李糖基) -β-D-吡喃葡萄糖基]氧代]-2,3-二氫-5-羥基-2-(4-羥基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮。柚皮素是柚皮苷水解掉一分子葡萄糖和鼠李糖得到的苷元，柚皮苷口服后，大部分是在腸道內(nèi)被腸道菌群脫糖基化代謝為柚皮素后經(jīng)腸壁被吸收入血[1-2]。柚皮苷廣泛存在于蕓香科植物葡萄柚、桔、橙等水果植物及化橘紅、骨碎補、枳實、枳殼、橘紅、菝葜等中藥中；在日常食用較多的橙汁及葡萄柚汁中也普遍含有柚皮苷[3]。尤其在葡萄柚汁中，柚皮苷的含量可達0.5 mg·mL-1[4]。

枸櫞酸噴托維林是非成癮性中樞鎮(zhèn)咳藥，1956年被合成后由比利時聯(lián)合化學公司(Ucb)開發(fā)，國內(nèi)于1962年開始生產(chǎn)。其鎮(zhèn)咳作用與可待因相當，除對延髓的呼吸中樞有直接抑制作用外，還有輕度的阿托品樣作用。臨床適用于具有無痰干咳癥狀的疾病，急性支氣管炎，慢性支氣管炎及各種原因引起的咳嗽均可應用[5-6]。柚皮苷廣泛存在于臨床上用于治療咳嗽、咯痰的中藥材或中成藥中[7-10]，與枸櫞酸噴托維林聯(lián)合使用的可能性很大。因此，有必要對柚皮苷和柚皮素與枸櫞酸噴托維林是否會發(fā)生相互作用進行研究，以提高用藥的安全性。

細胞色素P450 (CYP450)酶是肝臟和腸中最為重要的Ⅰ相代謝酶，可催化多種內(nèi)、外源物質(zhì)的(包括大多數(shù)臨床藥物)代謝；CYP450酶具有可誘導性和可抑制性。因此，藥物對CYP450酶活性的抑制或誘導是引發(fā)藥物相互作用的常見機制。目前，關于柚皮苷和柚皮素是否會通過影響CYP450酶活性來影響枸櫞酸噴托維林的代謝，尚未見文獻報道。本實驗采用體外溫孵法評估柚皮苷和柚皮素對枸櫞酸噴托維林經(jīng)大鼠肝微粒體代謝的影響，為臨床安全合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑 柚皮苷(由本團隊委托廣東環(huán)球制藥有限公司生產(chǎn)，純度>99%)；柚皮素(Sigma公司，純度>98%，批號：083K1328)；枸櫞酸噴托維林(中國生物制品檢定所，含量測定，批號：100432-200401)；曲安奈德(中國生物制品檢定所，含量測定，批號：100055-200302)；還原型輔酶Ⅱ四鈉(NADPH，廣州威佳生物科技有限公司，批號：2009/08)。

1.2 設備與儀器 DIONEX P680高效液相色譜儀(UVD 170U 紫外檢測器、ASI-100自動進樣器)，Chromeleon Client Programm色譜處理軟件(Dionex，美國)；TU-19101雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用公司)；高速離心機(3K-18，Sigma公司)；系列精密移液器(美國Rainin公司)。

1.3 實驗動物 Wistar大鼠，7周齡，雄性，體重200～220 g，SPF 級，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(粵)2008-0002。實驗動物飼養(yǎng)于中山大學生命科學學院動物房，動物使用許可證號為SYXK(粵)2004-0020，人工光循環(huán)12 h/12 h，溫度為(24±2.0)℃，濕度為55%±5%。動物實驗流程遵循中山大學有關實驗動物保護和使用的指南，并經(jīng)中山大學生命科學學院動物倫理委員會批準。

2 方法

2.1 溶液的配制 柚皮苷和柚皮素標準貯備液：精密稱取105 ℃干燥至恒重的柚皮苷對照品5.83 mg和柚皮素對照品2.86 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加250 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解，用0.1 mol·L-1Tris-KCl溶液定容，配制成濃度為1 mmol·L-1的母液，再分別精密吸取母液適量，置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol·L-1Tris-KCl溶液稀釋成濃度為100、10 μmol·L-1的標準貯備液，備用。噴托維林標準貯備液：精密稱取真空干燥至恒重的噴托維林對照品5.26 mg，置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol·L-1Tris-KCl溶解并定容，配制成濃度為1 mmol·L-1的母液，備用。曲安奈德內(nèi)標溶液：精密稱取真空干燥至恒重的曲安奈德對照品7.14 mg，置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.714 mg·mL-1的溶液，備用。

2.2 大鼠肝微粒體的制備 取SD大鼠，禁食24 h，頸椎脫臼處死，迅速打開腹腔取出肝臟，用0～4 ℃生理鹽水清洗至呈土黃色，吸干后稱肝質(zhì)量；取約1 g肝臟，加入3 mL勻漿液，于4 ℃條件下勻漿，勻漿液傾入預冷的離心管中，于10 500×g條件下離心30 min；取上清液與88 mmol·L-1CaCl2溶液混勻，使CaCl2終濃度為8.8 mmol·L-1，冰浴5 min后，于4 ℃和22 000 g條件下離心30 min；沉淀用重懸液重懸，采用BCA-100試劑盒測定肝微粒體蛋白含量，用Omura法測定CYP450酶的含量。

2.3 體外孵育條件確定 取制備好的大鼠肝微粒體，用重懸液稀釋成1.0 mg·mL-1蛋白濃度的混懸液，取此混懸液150 μL，加入一定量的藥物(底物)溶液混勻，于37 ℃預孵育5 min。用含NADPH的1%NaHCO3溶液20 μL(終濃度1 mmol·L-1)啟動反應，終體積為250 μL，于37 ℃下孵育一定時間后，置冰浴中終止反應，置于-20 ℃冰箱中保存待測。

2.4 枸櫞酸噴托維林測定方法學考察

2.4.1 色譜條件 色譜柱為大連依利特BDS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.05 mmol·L-1庚烷磺酸鈉(含0.3%三乙胺，pH 3.0)(45∶55)，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為210 nm。

2.4.2 樣品處理 在樣品中加入10 μL濃度為0.714 mg·mL-1的曲安奈德溶液后，加入200 μL甲醇,渦旋混合2 min后，離心10 min (12 000 rpm，4 ℃)，精密吸取20 μL進樣。

2.4.3 選擇性研究 分別配制3種溶液各150 μL，其中，一份為失活后的肝微粒體，作為空白體系，一份為失活后的肝微粒體加入枸櫞酸噴托維林及內(nèi)標曲安奈德，一份為肝微粒體加入枸櫞酸噴托維林，分別孵育后，按“2.4.2”項下方法處理并測定，考察大鼠肝微粒體中的雜質(zhì)對藥物的檢測是否存在干擾。

2.4.4 標準曲線繪制 取枸櫞酸噴托維林標準貯備液適量，加入滅活肝微粒體配制成濃度為5、25、50、75、100及125 μmol·L-1的150 μL標準曲線溶液，按“2.4.2”項下方法處理并測定，以待測物及內(nèi)標峰面積之比為縱坐標，以濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.4.5 準確度及精密度試驗 取肝微粒體和Tris-KCl溶液置于離心管中，分別加入枸櫞酸噴托維林標準貯備液，配成濃度為10、50和100 μmol·L-1的質(zhì)控樣品溶液，平行6份，按“2.4.2”項下方法處理并測定，計算準確度及精密度。

2.4.6 回收率試驗 取肝微粒體和Tris-KCl置于離心管中，分別加入枸櫞酸噴托維林標準貯備液，配成濃度為10、50及100 μmol·L-1的溶液，平行6份，按“2.4.2”項下方法處理并測定。另配制枸櫞酸噴托維林標準品溶液，通過二者的比值計算回收率。

2.5 代謝時間曲線研究 分別制備10、50及120 μmol·L-13個濃度的枸櫞酸噴托維林溶液，按上述孵育方法孵育15、30、45、60及90 min后，按“2.4.2”項下方法處理后用高效液相色譜(HPLC)法測定剩余枸櫞酸噴托維林的量，然后作出枸櫞酸噴托維林的代謝時間-濃度曲線，以確定最佳孵育時間。

2.6 枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中的代謝動力學研究 分別制備濃度為10、20、40、60、80、100和120 μmol·L-1的枸櫞酸噴托維林溶液，在肝微粒中孵育60 min后，按“2.4.2”項下操作，用HPLC測定剩余底物的量。根據(jù)Lineweaver-Burk方程式：1/V=Km/(Vmax×[S])+1/Vmax，以底物濃度的倒數(shù)1/[S]對反應速度的倒數(shù)1/V進行線性回歸，截距的倒數(shù)即為最大反應速度(Vmax)，斜率乘以Vmax即為米氏常數(shù)(Km)。

2.7 柚皮苷和柚皮素對枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中代謝的影響 采用一系列濃度的柚皮苷和柚皮素溶液(180、90、30、10、3.3、1.1、0.33及0.11 μmol·L-1)與枸櫞酸噴托維林溶液進行共孵育60 min后，按“2.4.2”項下操作，用HPLC測定剩余枸櫞酸噴托維林的量。同時設置空白對照，研究不同濃度的柚皮苷和柚皮素對枸櫞酸噴托維林代謝的影響。

2.8 統(tǒng)計學分析 本實驗數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標準差”表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

3 結(jié)果

3.1 枸櫞酸噴托維林測定方法學結(jié)果

3.1.1 選擇性 如圖1所示，在選定的色譜條件下，枸櫞酸噴托維林的保留時間為7.0 min左右，空白體系在枸櫞酸噴托維林及內(nèi)標保留時間無雜質(zhì)峰干擾，提示本HPLC檢測方法具有良好的選擇性。

A.空白孵育體系圖譜；B.空白孵育體系加入枸櫞酸噴托維林和內(nèi)標的圖譜；C.肝微粒體體系中加入枸櫞酸噴托維林和內(nèi)標孵育后的圖譜 1.枸櫞酸噴托維林；2.內(nèi)標

3.1.2 準確度、精密度和回收率試驗 如表1所示，采用本條件下的HPLC法測定枸櫞酸噴托維林樣品，準確度及精密度試驗的偏差值均小于±15%，回收率均在90.0%～110.0%范圍內(nèi)，符合生物樣品分析方法的要求。說明該測定方法準確度、精密度、回收率良好，符合生物樣品檢測要求，適用于枸櫞酸噴托維林的檢測。

表1 準確度、精密度和回收率試驗結(jié)果(n=6)

3.1.3 標準曲線和線性范圍 結(jié)果顯示，在5～125 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，標準曲線方程為Y=0.031 5X-0.019 5,R2=0.999 8。說明在該線性范圍內(nèi)，枸櫞酸噴托維林的濃度與色譜峰面積之間線性關系良好。

3.2 枸櫞酸噴托維林代謝時間-濃度曲線研究 如表2所示，在方法學開發(fā)試驗中，當孵育時間達到60 min，枸櫞酸噴托維林的代謝已基本達到平臺期，符合試驗要求。因此，在方法學驗證試驗及樣品測定試驗中，選擇60 min作為孵育體系的代謝時間。

表2 枸櫞酸噴托維林代謝時間-濃度變化結(jié)果(n=3)

3.3 枸櫞酸噴托維林酶動力學研究 根據(jù)Lineweaver-Burk方程式得到的曲線方程為Y=16 685X+575.21(X為底物濃度的倒數(shù)，Y為反應速度的倒數(shù)，R2=0.991)，求得Vmax為1.74 nmol·(min·mg)-1，Km為29.00 μmol·L-1。因此，確定30 μmol·L-1作為枸櫞酸噴托維林的代謝反應的底物濃度。

3.4 柚皮苷和柚皮素對枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中代謝的影響 柚皮苷和柚皮素對枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中代謝的影響結(jié)果見表3。以空白對照組代謝量為100%，計算柚皮苷和柚皮素對枸櫞酸噴托維林經(jīng)大鼠肝微粒體代謝的相對抑制率。經(jīng)統(tǒng)計學分析，柚皮苷和柚皮素各劑量組的代謝量與空白對照組的代謝量無顯著性差異(P>0.05)。說明柚皮苷和柚皮素濃度在(0.11～180) μmol·L-1范圍內(nèi)對枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中的代謝無明顯影響。

表3 柚皮苷和柚皮素對枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中代謝的影響(n=3)

4 討論

柚皮苷及其苷元柚皮素廣泛存在于多種植物或中藥中，近年來，越來越多的研究報道其各種藥理活性，如，抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗炎、改善神經(jīng)功能障礙、改善糖脂代謝紊亂、抗動脈粥樣硬化、抗癌等藥理作用[11-15]。在我國，隨著中西醫(yī)結(jié)合的深入發(fā)展，中西藥物并用的用藥方式日趨普遍。因此，研究柚皮苷及其苷元柚皮素與臨床常用藥物之間的相互作用是十分必要的。

枸櫞酸噴托維林是非成癮性中樞鎮(zhèn)咳藥，臨床用于具有無痰干咳癥狀的疾病，急性支氣管炎、慢性支氣管炎及各種原因引起的咳嗽可應用[5]。枸櫞酸噴托維林也是多種復方止咳祛痰藥的主要成分[16-18]。雖然枸櫞酸噴托維林在臨床應用時間已超過60年，但是，關于其藥代動力學的研究報道依然很少。目前，未見文獻報道枸櫞酸噴托維林是被何種肝藥酶亞型所代謝。

本實驗采用體外溫孵法評估柚皮苷和柚皮素對枸櫞酸噴托維林經(jīng)大鼠肝微粒體代謝的影響，研究結(jié)果表明，在濃度為(0.11～180) μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，柚皮苷和柚皮素均未對枸櫞酸噴托維林經(jīng)大鼠肝微粒體代謝產(chǎn)生顯著影響，提示柚皮苷和柚皮素不影響枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中的代謝。